[發明專利]一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202011320403.6
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112410235A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 張云豐;羅小舟
• 申請（專利權）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12P7/22;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市廣諾專利代理事務所(普通合伙) 44611
• 代理人: 祝晶

1.一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟01、構建一株產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A；

步驟02、通過基因編輯技術在產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A中插入TKS酶和OAC酶，獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B。

2.根據權利要求1所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述方法還包括：

步驟03、在高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B中篩選OAC酶的表達啟動子獲得最佳表達啟動子，并利用最佳表達啟動子插入2個拷貝數的OAC基因，獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株C。

3.根據權利要求1或2所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述步驟02包括：

步驟21、以產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A為基礎，通過引物F1/R1進行PCR擴增得到1622位點上游1000bp同源臂片段1622b-Up，引物F2/R2進行擴增獲得融合的TKS-OAC片段，引物F3/R3進行擴增獲得1622b位點下游1000bp同源臂片段1622b-Down；

步驟22、通過醋酸鋰/PEG3350化學轉化方法，將上述3個片段轉化產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A；

步驟23、利用CRISPR-Cas9基因編輯工具，在基因序列為

TAAAGCCACCACATCGCAAA的gRNA的引導下對1622b位點進行雙鏈斷裂切割DNA；

步驟24、產大麻萜酚的釀酒酵母菌株A內的同源重組酶將1622b-Up、TKS-OAC和1622b-Dp三個片段連接成一個片段，最后通過位于TKS-OAC兩端的1622b-Up和1622b-Dp同源臂，在1622b位點整合TKS-OAC表達框；

步驟25、通過營養缺陷性的組成培養基篩選轉化陽性克隆獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B。

4.根據權利要求3所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，每個PCR擴增的片段之間包含50bp的同源臂序列。

5.根據權利要求2所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，所述步驟03包括：

步驟31、以高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B為基礎，通過引物F5/R5進行PCR擴增得到YPRCd15c位點上游1000bp同源臂片段YPRCd15c-Up，引物F6/R6進行擴增獲得表達啟動子pTDH3，引物F7/R7進行擴增獲得OAC-ENO1t編碼序列，引物F8/R8進行擴增獲得YPRCd15c位點下游1000bp同源臂片段YPRCd15c-Down；

步驟32、通過醋酸鋰/PEG3350化學轉化方法，將上述4個片段轉化為高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B；

步驟33、利用CRISPR-Cas9基因編輯工具，在基因序列為

AATCCGAACAACAGAGCATA的gRNA的引導下對YPRCd15c位點進行雙鏈斷裂切割DNA；

步驟34、高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株B內的同源重組酶將上述4個片段連接成1個片段，最后通過位于OAC表達框上下游的YPRCd15c-Up和YPRCd15c-Dp同源臂，在YPRCd15c位點整合TKS-OAC表達框；

步驟35、通過營養缺陷性的組成培養基篩選轉化陽性克隆獲得高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株C。

6.根據權利要求5所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株的構建方法，其特征在于，每個PCR擴增的片段之間包含50bp的同源臂序列。

7.一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株通過權利要求1所述的構建方法構建而成。

8.一種高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株，其特征在于，所述高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株通過權利要求2所述的構建方法構建而成。

9.一種權利要求7或8所述的高產大麻萜酚的釀酒酵母菌株在產大麻萜酚酸中的應用。