[發明專利]細胞轉染方法

在審

• 申請號: 202011320159.3
• 申請日: 2013-04-19
• 公開（公告）號: CN112626128A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: S·G·蒂亞克
• 申請（專利權）人: 聯邦科學技術研究組織;安偉捷公司
• 主分類號: C12N15/88
• 分類號: C12N15/88;C12N15/873;A01K67/027;C12N5/076
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發明涉及轉染細胞的方法。具體地，本發明涉及轉染禽類中原生殖細胞的方法，以及繁殖具有修飾性狀的禽類的方法。

本申請是申請日為2013年4月19日，申請號為201380031734.X，題目為的“細胞轉染方法”的專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及轉染細胞的方法。具體地，本發明涉及轉染禽類中原生殖細胞的方法，以及繁殖具有修飾性狀的禽類的方法。

背景技術

用以開發轉基因或基因修飾禽類的有效技術的發展對于農業和生物制藥產業，以及通過功能基因組學研究增加我們對禽類生物學的了解均至關重要。在面臨人口增長時，家禽生產在確保全球食品安全中將扮演重要角色，當今生物技術的進步，例如轉基因家禽的發展將有助于該產業滿足增產的需求。

更具體地，應用轉基因技術修飾家禽中無法通過傳統育種獲得的性狀，例如抗病性和性別決定調節，如今成為可能，并為家禽產業提供巨大好處。對于生物制藥蛋白的需求迅速增長，直到最近仍在使用基于細胞的體外制造系統，其生產用于疾病治療的新重組蛋白。轉基因家畜作為重組蛋白生產的生物反應器的應用如今正發展為昂貴且勞動密集的基于細胞的系統的主要替代。雞轉基因技術的發展使得雞蛋被開發成用于高水平生產和純化生物制藥蛋白的生物反應器。

也有試圖導入選定的外源基因，其通過將所述外源基因克隆入逆轉錄病毒載體(例如網狀內皮病毒或禽類白血病病毒)，將重組病毒注入受精卵，允許病毒感染發育中的胚胎(例如原生殖細胞)從而建立嵌合性腺或卵細胞，以及使用得到的重組體嘗試將外源基因導入后代。然而養禽業不愿意商業化使用該技術，因為病毒(處于天然狀態)是病原體，甚至不同的復制活性的病毒載體某些時候能引起腫瘤，而復制非活性變體需要較高或反復的劑量。甚至復制缺陷的病毒構建體也能造成與內源病毒包膜重組從而變成復制活性的風險。另外，這些載體目前局限于尺寸相對較小(例如2kb或更小)的DNA插入片段。

也有試圖將外源DNA注入通過手術從母雞中取出的未發育的受精卵中。然而，該方法需要將發育的胚胎在一系列代孕容器中孵育。另外，其需要專門的產卵群體(layingflock)和反復的練習以獲得所需的手術和技術技能。

可替代的方法包括將基因修飾的胚胎細胞或原生殖細胞(PGC)注入產卵后不久的受體胚胎。在該方法中，生成PCG培養物，其保留了分化成功能性卵細胞或精子的能力，所述卵細胞或精子在整合入發育的胚胎中時產生細胞。該類型的PCG培養物能被基因修飾，然后注入受體胚胎。所述受體胚胎通常會通過γ輻照修飾，削弱內源原生殖細胞，從而給予被注入的細胞定植于性腺嵴的選擇優勢。被修飾的細胞繼而會成熟并產生能夠將轉基因傳遞到至少下一代的精子或卵細胞。然而，該技術因其需要將PGC從供體胚胎中移除，及其后續培養并重新導入受體胚胎而非常耗時。另外，使用該技術所能獲得的包含基因修飾的PGC的禽類的效率很低。

因此，仍有對基因修飾禽類原生殖細胞的方法的需求。

發明概述

本發明人發現，將與DNA混合的轉染試劑直接注入發育的禽類胚胎血液中導致DNA被導入原生殖細胞(PGC)，并且所述DNA插入所述禽類的基因組。

相應地，本發明提供用于產生包含基因修飾的生殖細胞的禽類的方法，所述方法包含：

(i)將包含與轉染試劑混合的多核苷酸的轉染混合物注入禽類胚胎的血管中，由此所述多核苷酸插入所述禽類中的一或多個生殖細胞的基因組中。

在一個實施方案中，所述方法進一步包含(ii)將所述胚胎在足以使所述胚胎發育成小鳥的溫度下孵育。

所述轉染混合物優選被注入處于約階段12-17PGC遷移時的禽類胚胎。在一個優選實施方案中，所述轉染混合物被注入處于階段13-14的禽類胚胎。

盡管任意適合的轉染試劑均可用于本發明的方法，但優選包含陽離子脂質的轉染試劑。