[發(fā)明專利]一種優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011319520.0
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN114369541A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張云豐;羅小舟
• 申請（專利權(quán)）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市廣諾專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44611
• 代理人: 祝晶

1.一種優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟01、構(gòu)建釀酒酵母yG010，在高產(chǎn)大麻萜酚酸菌株yG003基因組中采用pTDH3啟動子表OAC基因；

步驟02、替換釀酒酵母yG010基因組中的內(nèi)源脂肪酸合成酶FASI的啟動子，得到重組釀酒酵母yG011。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟03、以重組釀酒酵母yG011的基因組為模板，替換基因組中的MvaE酶的啟動子，得到系列重組釀酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟02包括：

步驟21、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到上游同源臂FAS1-Up片段；

步驟22、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到下游同源臂FAS1-Down片段；

步驟23、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到pHXT1片段；

步驟24、將FAS1-Up、pHXT1、FAS1-Down作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母yG010中，獲得調(diào)控FASI表達(dá)水平的重組釀酒酵母yG011。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟03包括：

步驟31、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到上游同源臂MvaE-Up片段；

步驟32、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到下游同源臂MvaE-Down片段；

步驟33、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到pHXK1等啟動子片段；

步驟34、將MvaE-Up、pHXK1等啟動子片段、MvaE-Down作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，獲得調(diào)控MvaE表達(dá)水平的系列重組釀酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟03包括：

步驟31、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到上游同源臂MvaE-Up片段；

步驟32、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到下游同源臂MvaE-Down片段；

步驟33、以初始釀酒酵母yG010的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到pHXK1等啟動子片段；

步驟33、MvaE-Up、pHXK1等啟動子片段、MvaE-Down作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，獲得調(diào)控MvaE表達(dá)水平的系列重組釀酒酵母yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的調(diào)控FASI表達(dá)水平的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，轉(zhuǎn)化至釀酒酵母的方法為醋酸鋰/PEG3350法；

所述醋酸鋰/PEG3350法的步驟包括：將釀酒酵母接種到1xYPD培養(yǎng)基中使起始OD值為0.2，培養(yǎng)4-4.5h，根據(jù)構(gòu)建菌株數(shù)，通過離心、洗滌后收集細(xì)胞；

插入片段的用量為：每5OD釀酒酵母菌液中的細(xì)胞，對應(yīng)使用50μL DNA混合物懸浮該細(xì)胞，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具質(zhì)粒以及足量ddH2O混合而成；

插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母后，將收集到的細(xì)胞涂布到缺少尿嘧啶的篩選平板上，獲取單克隆菌落，測序驗證后進(jìn)行保存。