[發(fā)明專利]一種優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011319520.0
• 申請(qǐng)日: 2020-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114369541A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)曝S;羅小舟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市廣諾專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44611
• 代理人: 祝晶

本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該方法包括步驟01、構(gòu)建釀酒酵母yG010；步驟02、替換釀酒酵母yG010基因組中的內(nèi)源脂肪酸合成酶FASI的啟動(dòng)子，得到重組釀酒酵母yG011；步驟03、替換釀酒酵母yG011基因組中MvaE的表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明通過(guò)調(diào)控酵母細(xì)胞內(nèi)源脂肪酸合成酶FASI的表達(dá)水平及內(nèi)源甲羥戊酸合成通路(MVA)中MvaE酶的表達(dá)水平來(lái)解決合成路徑中對(duì)前體乙酰輔酶A不均衡競(jìng)爭(zhēng)及分配的問(wèn)題，達(dá)到高產(chǎn)大麻萜酚酸的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域基因工程改造技術(shù)，更具體地，本發(fā)明涉及在釀酒酵母中通過(guò)甲羥戊酸合成通路中酶 MvaE 及內(nèi)源脂肪酸合成酶 FASI 的表達(dá)水平構(gòu)建的高產(chǎn)大麻二酚酸的菌株構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

大麻二酚酸 CBGA 是合成物中的重要前體化合物，其從頭生物合成途徑如附圖 1所示。

在合成大麻二酚酸 CBGA 的途徑中，三條中間產(chǎn)物的合成路徑同時(shí)利用前體乙酰輔酶 A（如附圖 1 所示）。由于對(duì)乙酰輔酶 A 的競(jìng)爭(zhēng)能力不同導(dǎo)致了乙酰輔酶 A 在三條通路中的不平衡分配結(jié)果，進(jìn)而影響到終產(chǎn)物 CBGA 的合成。

因此，市面上亟需一種能夠解決上述一個(gè)或者多個(gè)問(wèn)題的一種在釀酒酵母中通過(guò)甲羥戊酸合成通路中酶 MvaE 及內(nèi)源脂肪酸合成酶 FASI 的表達(dá)水平構(gòu)建的高產(chǎn)大麻二酚酸的菌株構(gòu)建方法和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個(gè)或者多個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種在釀酒酵母中通過(guò)甲羥戊酸合成通路中酶 MvaE 及內(nèi)源脂肪酸合成酶 FASI 的表達(dá)水平構(gòu)建的高產(chǎn)大麻二酚酸的菌株構(gòu)建方法和應(yīng)用。

本發(fā)明為達(dá)到上述目的所采用的技術(shù)方案是：一種優(yōu)化代謝流產(chǎn)大麻萜酚酸的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，所述方法包括：

步驟 01、構(gòu)建釀酒酵母 yG010，在高產(chǎn)大麻萜酚酸菌株 yG003 基因組中采用pTDH3 啟動(dòng)子表OAC 基因；

步驟 02、替換釀酒酵母 yG010 基因組中的內(nèi)源脂肪酸合成酶FASI 的啟動(dòng)子，得到重組釀酒酵母yG011。

在一些實(shí)施例中，所述方法包括：

步驟 03、以重組釀酒酵母 yG011 的基因組為模板，替換基因組中的 MvaE 酶的啟動(dòng)子，得到系列重組釀酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

在一些實(shí)施例中，所述步驟 02 包括：

步驟 21、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到上游同源臂 FAS1-Up 片段；

步驟 22、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到下游同源臂 FAS1-Down 片段；

步驟 23、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到 pHXT1片段；

步驟 24、將 FAS1-Up 、pHXT1、FAS1-Down 作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母yG010中，獲得調(diào)控FASI 表達(dá)水平的重組釀酒酵母 yG011。

在一些實(shí)施例中，所述步驟 03 包括：

步驟 31、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；

步驟 32、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；

步驟 33、以初始釀酒酵母 yG010 的基因組為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到 pHXK1

等啟動(dòng)子片段；