[發(fā)明專利]一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011318980.1
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112626064B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊洪江;李東航;秦旭穎;龐文靜;張志強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發(fā)明涉及一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)，構(gòu)建步驟如下：⑴構(gòu)建一個在ITRs區(qū)域中額外添加了轉(zhuǎn)座酶基因tnpA的新型轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體；⑵在ITRs區(qū)域中額外添加的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA能夠受到阿拉伯糖啟動子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC調(diào)控；⑶獲得一個含有轉(zhuǎn)座子的不同物種的轉(zhuǎn)座子突變株；⑷該轉(zhuǎn)座子突變株在基因組的任一位置上具有一個轉(zhuǎn)座子插入序列；⑸隨機(jī)獲得全基因組范圍內(nèi)多種插入基因形式的轉(zhuǎn)座子突變株文庫。本發(fā)明構(gòu)建系統(tǒng)可以系統(tǒng)高效地得到覆蓋全基因組的革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)座子突變株文庫，有助于研究基因組注釋和功能分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)。

背景技術(shù)

隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的生物基因組注釋結(jié)果表明：轉(zhuǎn)座子幾乎存在于所有生物的基因組中，是大多數(shù)生物基因組的重要組分。其中，Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子是自然界中分布最廣泛的一類DNA轉(zhuǎn)座子超家族，在自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14個有活性的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子(如Minos，Mos1等)，另外通過分子重構(gòu)也獲得高活性的人工轉(zhuǎn)座子，如睡美人轉(zhuǎn)座子(Sleeping Beauty，SB)。SB和Mos1等轉(zhuǎn)座子作為基因轉(zhuǎn)移載體已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、基因捕獲和基因治療等領(lǐng)域的研究中，并取得了很好的應(yīng)用效果。

Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子家族成員的全長一般為1300～2400bp，其中包含一個單基因編碼的轉(zhuǎn)座酶，側(cè)翼為反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITRs)。當(dāng)轉(zhuǎn)座酶與ITRs結(jié)合時，可以促進(jìn)轉(zhuǎn)座的發(fā)生。Tc1/Mariner作為一種重要的基因工程工具，可以利用它們轉(zhuǎn)座序列和轉(zhuǎn)座酶可以分離的特征去構(gòu)建轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。當(dāng)前轉(zhuǎn)座子文庫系統(tǒng)一般采用接合轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行構(gòu)建，但以此方法構(gòu)建出來的轉(zhuǎn)座子文庫存在效率偏低，操作繁瑣且文庫容量小等缺點。

為解決當(dāng)前文庫構(gòu)建時存在的問題，使得轉(zhuǎn)座子使用更加廣泛，本發(fā)明提供了一種新型轉(zhuǎn)座子突變文庫的構(gòu)建系統(tǒng)，此方法不要求接合轉(zhuǎn)移效率，只需一個含有轉(zhuǎn)座子的突變株，就能得到幾乎覆蓋全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)座子突變文庫。這種新型轉(zhuǎn)座子文庫的構(gòu)建系統(tǒng)不僅可以增大轉(zhuǎn)座突變的多樣性，更有助于菌株插入位置的確定。

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座子突變文庫。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)，構(gòu)建步驟如下：

⑴模仿天然的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，人工構(gòu)建了一個在ITRs區(qū)域中額外添加了轉(zhuǎn)座酶基因tnpA的新型轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體；

⑵在ITRs區(qū)域中額外添加的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA受到阿拉伯糖啟動子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC調(diào)控；

⑶先將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒化轉(zhuǎn)到E.coli S17-1λpir中，再利用常見的接合轉(zhuǎn)移mating方法，獲得一個含有轉(zhuǎn)座子的不同物種的轉(zhuǎn)座子突變株；

⑷該轉(zhuǎn)座子突變株在基因組的任一位置上具有一個轉(zhuǎn)座子插入序列，該插入序列包括：兩端的ITRs區(qū)域，阿拉伯糖啟動子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和轉(zhuǎn)座酶基因tnpA；

⑸擴(kuò)增培養(yǎng)一個轉(zhuǎn)座子突變株，在細(xì)胞數(shù)達(dá)到10¹²cfu/mL時，添加終濃度為2mg/ml的阿拉伯糖，誘導(dǎo)培養(yǎng)2h使轉(zhuǎn)座子跳躍，隨機(jī)獲得全基因組范圍內(nèi)多種插入基因形式的轉(zhuǎn)座子突變株文庫。

而且，所述步驟⑴中轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體具有如下特征：

①去除了tnpA轉(zhuǎn)座酶基因的pKKma轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒基因序列；