[發(fā)明專利]一種新型轉(zhuǎn)座子突變株文庫的構(gòu)建系統(tǒng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011318980.1
• 申請(qǐng)日: 2020-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN112626064B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊洪江;李東航;秦旭穎;龐文靜;張志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/70;C12N15/54;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種構(gòu)建突變株文庫的新型轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，其特征在于：構(gòu)建步驟如下：

模仿天然的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，人工構(gòu)建一個(gè)在ITRs區(qū)域中額外添加了轉(zhuǎn)座酶基因tnpA的新型轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體；

在ITRs區(qū)域中額外添加的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA能夠受到阿拉伯糖啟動(dòng)子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC調(diào)控；

先將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒化轉(zhuǎn)到E .coli S17-1 λpir中，再利用接合轉(zhuǎn)移mating方法，獲得一個(gè)含有轉(zhuǎn)座子的不同物種的轉(zhuǎn)座子突變株；

該轉(zhuǎn)座子突變株在基因組的任一位置上具有一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入序列，該插入序列包括：兩端的ITRs區(qū)域，阿拉伯糖啟動(dòng)子基因araBAD，阿拉伯糖抑制蛋白基因araC和轉(zhuǎn)座酶基因tnpA；

擴(kuò)增培養(yǎng)一個(gè)轉(zhuǎn)座子突變株，在細(xì)胞數(shù)達(dá)到10¹² cfu/mL時(shí)，添加終濃度為2 mg/ml的阿拉伯糖，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h使轉(zhuǎn)座子跳躍，隨機(jī)獲得全基因組范圍內(nèi)多種插入基因形式的轉(zhuǎn)座子突變株文庫；

所述步驟中轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體具有如下特征：

去除了tnpA轉(zhuǎn)座酶基因的pKKma轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒基因序列；

在ITRs區(qū)域中加入了阿拉伯糖啟動(dòng)子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC；

在ITRs區(qū)域中加入了受阿拉伯糖調(diào)控的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA；

所述pKKma轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的核苷酸序列為SEQ ID NO.1；

所述步驟中tnpA轉(zhuǎn)座酶的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3；

所述步驟中新型轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體的核苷酸序列為SEQ ID NO.4；

所述步驟中先將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體化轉(zhuǎn)到E .coli S17-1 λpir中，獲得含有穩(wěn)定表達(dá)且受阿拉伯糖調(diào)控的轉(zhuǎn)座酶基因tnpA的大腸桿菌菌株，再利用常見的接合轉(zhuǎn)移mating方法，獲得一個(gè)含有轉(zhuǎn)座子的其他物種的轉(zhuǎn)座子突變株；

所述步驟中能夠根據(jù)構(gòu)建文庫的需求，控制轉(zhuǎn)座子突變株的菌濃和體積，且轉(zhuǎn)座酶誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子跳躍的過程是能夠調(diào)控的；

所述步驟中編碼阿拉伯糖啟動(dòng)子基因araBAD和阿拉伯糖抑制蛋白基因araC的核苷酸序列為SEQ ID NO.2；

所述方法能夠得到覆蓋全基因的多種基因插入形式的全基因組轉(zhuǎn)座子文庫。