[發明專利]一種確定文庫擴增循環數的方法

在審

• 申請號: 202011317692.4
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN112410406A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 楚玉星;楊玲;王一茜;王珺;洪立梅;吳善旋;李奇
• 申請（專利權）人: 深圳基因家科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C40B50/06;C12Q1/6806
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 周建軍;郭燕

1.一種確定文庫擴增循環數的方法，其特征在于，包括：在文庫擴增之前，預先對待測樣本進行實時熒光定量PCR檢測，獲得待測樣本的實時熒光定量PCR檢測CT值，根據所述CT值確定后續文庫擴增所需的循環數。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述文庫擴增的循環數＝M+N，所述M為CT值的小數點后第一位四舍五入后的整數，所述N為-4～7，優選為0～7，更優選為1～7；

任選地，如果文庫擴增后，上機測序之前，不再對待測樣本進行雜交捕獲，則N為0～2；

任選地，如果文庫擴增后，上機測序之前，需要對待測樣本進行雜交捕獲，則N為3～7。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測樣本為RNA樣本經過逆轉錄得到的cDNA。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述cDNA為雙鏈；

任選地，所述cDNA為連接有接頭的cDNA。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，實時熒光定量PCR反應體系中含有DNA聚合酶、鎂離子、dNTP、熒光染料、熱啟動試劑、PCR增強劑、PCR穩定劑中的至少一種；

任選地，所述DNA聚合酶選自熱啟動DNA聚合酶，優選為Taq DNA聚合酶；

任選地，所述熒光染料選自SYBR green I、EvaGreen、Lc Green、SYTO、BEBO、BETO、BETIBO、BOXTO中的至少一種；

任選地，所述實時熒光定量PCR反應體系中還含有引物；

任選地，實時熒光定量PCR反應條件依次如下：90-98℃，30s-10min；然后進入30-40個循環，每個循環如下：90-98℃，15-60s，55-65℃，30-60s，70-75℃，30-60s；循環結束后，70-75℃，30s-10min。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述RNA樣本的來源選自生物體的全血、新鮮組織、石蠟包埋組織、口腔脫落細胞、細胞系、糞便、尿液、外泌體中的至少一種；

任選地，所述生物體選自動物、植物、原核生物、原生生物、微生物中的至少一種；

任選地，所述動物包括人，所述微生物為細菌、病毒、真菌中的至少一種；

任選地，所述RNA樣本選自總RNA、mRNA、LncRNA、circRNA中的至少一種。

7.一種建庫方法，其特征在于，包括對RNA樣本進行前處理，得到待測樣本，然后采用權利要求1-6任意一項所述方法進行實時熒光定量PCR檢測，獲得實時熒光定量PCR檢測CT值，根據所述CT值確定后續文庫擴增所需的循環數，再按照所述循環數進行文庫擴增，得到可用于上機測序的文庫。

8.如權利要求7所述的建庫方法，其特征在于，所述RNA樣本的起始投入量為5ng-1μg。

9.如權利要求7所述的建庫方法，其特征在于，若所述RNA樣本為總RNA，所述前處理包括，依次對所述RNA樣本進行rRNA去除、打斷、逆轉錄、二鏈合成及末端修復加A、接頭連接、純化；

任選地，文庫擴增后，對所得產物進行純化處理，然后上機測序。

10.如權利要求7所述的建庫方法，其特征在于，還包括在上機測序之前，對純化的產物進行雜交捕獲；

任選地，若需要篩選特定的RNA，則在打斷處理之前，先對RNA樣本進行篩選；

任選地，所述特定的RNA為mRNA、LncRNA、circRNA中的至少一種。