[發(fā)明專利]一種體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011315827.3
• 申請(qǐng)日: 2020-11-22
• 公開（公告）號(hào): CN112375732A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃秀珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市奧宇科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076;C12N5/02;C08J9/40;C08L67/04
• 代理公司: 廣州中粵知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44752
• 代理人: 楊毅宇

本發(fā)明提供了一種體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法。該方法包括以下步驟：在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)容器中，將精原干細(xì)胞懸液接種于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上，加入改良的RPMI?1640培養(yǎng)基，在30～34℃下進(jìn)行三維靜態(tài)培養(yǎng)，待精原干細(xì)胞粘附于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上后，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)，在30～34℃下進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)。使用本發(fā)明方法能在無添加飼養(yǎng)層細(xì)胞的前提下，實(shí)現(xiàn)小鼠SSCs體外大規(guī)模擴(kuò)增，并獲得良好的干細(xì)胞增殖活性及未分化活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是一類存在于雄性動(dòng)物體睪丸內(nèi)生精小管內(nèi)側(cè)壁的一類維持增殖和分化平衡的成體干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過程中，SSCs可以自發(fā)表觀重組轉(zhuǎn)變成為具有和胚胎干細(xì)胞類似生物學(xué)功能的多能干細(xì)胞。是成體干細(xì)胞研究的一個(gè)重點(diǎn)。

Kanatsu-Shinohara實(shí)驗(yàn)室在2003年成功建立了小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，經(jīng)過10余年的發(fā)展，小鼠SSCs分離培養(yǎng)技術(shù)日臻成熟，小鼠SSCs成為生殖干細(xì)胞研究主要細(xì)胞材料和模型。然而，SSCs培養(yǎng)體系要求苛刻，依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞，易造成飼養(yǎng)層細(xì)胞存在帶來的外源基因污染、免疫排斥等問題，此外，因?yàn)榇嬖陲曫B(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致SSCs轉(zhuǎn)基因工作難以進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因效率低，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選困難。飼養(yǎng)層細(xì)胞是經(jīng)過一定的化學(xué)或射線處理后所得到的有絲分裂過程受到抑制的單層細(xì)胞，這些細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂增殖卻依然保持著代謝活性，可以分泌一系列已知或未知的可溶性膜結(jié)合生長(zhǎng)因子和受體來促進(jìn)干細(xì)胞的增殖并抑制其分化，使其保持干細(xì)胞未分化活性，還可通過為干細(xì)胞提供空間支持，進(jìn)行必要的物理支持而促進(jìn)干細(xì)胞增殖。雖然已有報(bào)道采用無飼養(yǎng)層無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)小鼠SSCs，其是通過向培養(yǎng)基中添加大量的各種生長(zhǎng)因子或其它物質(zhì)來替代飼養(yǎng)層細(xì)胞的作用，不僅培養(yǎng)成本較高，而且SSCs細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，容易造成自然分化。主要是由于通過飼養(yǎng)層細(xì)胞的物理接觸而刺激產(chǎn)生的旁分泌及相關(guān)的一些蛋白，是無法通過簡(jiǎn)單的添加而解決的。通過物理支持和生長(zhǎng)因子的分泌，飼養(yǎng)層細(xì)胞作為一個(gè)整體，為目的細(xì)胞的增殖及抑制分化提供了系統(tǒng)的支持。

另一方面，現(xiàn)有的小鼠SSCs體外培養(yǎng)方式大部分為二維平面培養(yǎng)，傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)并不能夠提供細(xì)胞組織正常發(fā)育所需的環(huán)境條件，因而細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其分化、基因表達(dá)等。三維培養(yǎng)是利用各種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方式生長(zhǎng)，更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)模式，形成類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，更有利于細(xì)胞功能的保持和發(fā)揮。目前關(guān)于小鼠SSCs體外三維培養(yǎng)的研究相對(duì)較少，且關(guān)于小鼠SSCs三維培養(yǎng)的報(bào)道大部分還是需要依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞的作用。因此，有必要提供一種新型的體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法，在無添加飼養(yǎng)層細(xì)胞的前提下，實(shí)現(xiàn)小鼠SSCs體外大規(guī)模擴(kuò)增，并獲得良好的干細(xì)胞增殖活性及未分化活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法，該方法在無添加飼養(yǎng)層細(xì)胞的前提下，實(shí)現(xiàn)小鼠SSCs體外大規(guī)模擴(kuò)增，并獲得良好的干細(xì)胞增殖活性及未分化活性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種體外擴(kuò)增精原干細(xì)胞的3D懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)容器中，將精原干細(xì)胞懸液接種于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上，加入改良的RPMI-1640培養(yǎng)基，在30～34℃下進(jìn)行三維靜態(tài)培養(yǎng)，待精原干細(xì)胞粘附于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上后，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)，在30～34℃下進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述的精原干細(xì)胞在培養(yǎng)體系中接種的細(xì)胞密度為5×10⁴～8×10⁴個(gè)/mL；所述的RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球在培養(yǎng)體系中的使用濃度為8～10mg/mL。

優(yōu)選地，所述的三維靜態(tài)培養(yǎng)是在30～34℃、5％CO₂下培養(yǎng)4～6h。