[發明專利]一種體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法

在審

• 申請號: 202011315827.3
• 申請日: 2020-11-22
• 公開（公告）號: CN112375732A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 黃秀珍
• 申請（專利權）人: 廣州市奧宇科技有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;C12N5/02;C08J9/40;C08L67/04
• 代理公司: 廣州中粵知識產權代理事務所(普通合伙) 44752
• 代理人: 楊毅宇

1.一種體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，包括以下步驟：在旋轉生物反應容器中，將精原干細胞懸液接種于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上，加入改良的RPMI-1640培養基，在30～34℃下進行三維靜態培養，待精原干細胞粘附于RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球上后，啟動旋轉系統，在30～34℃下進行三維動態懸浮培養。

2.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的精原干細胞在培養體系中接種的細胞密度為5×10⁴～8×10⁴個/mL；所述的RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球在培養體系中的使用濃度為8～10mg/mL。

3.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的三維靜態培養是在30～34℃、5％CO₂下培養4～6h。

4.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的三維動態懸浮培養是在30～34℃、5％CO₂、15～20r/min下培養，并且三維動態培養過程中需控制培養體系無氣泡，隔天半量更換培養液。

5.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽修飾多孔聚乳酸微球，所述的多孔聚乳酸微球的粒徑為100～300μm，密度為1.00～1.10g/cm³，孔徑為30～50μm。

6.根據權利要求5所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球的制備包括如下步驟：稱取0.2g多孔聚乳酸微球于10mLMES緩沖液中，超聲下分散，加入1mL含0.7M NHS和0.1M EDC的MES緩沖液反應1h，收集反應后的多孔聚乳酸微球，用MES緩沖液洗滌除去未反應的NHS和EDC，然后加入5mL PBS緩沖液形成微球懸浮液，將20mg RGD多肽加入懸浮液中，于磁力攪拌器上攪拌過夜，真空干燥，即得RGD多肽修飾多孔聚乳酸微球。

7.根據權利要求1、5或6所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的多孔聚乳酸微球的制備包括如下步驟：稱取2g聚乳酸溶于20mL二氯甲烷，攪拌溶解，然后加入質量分數為5％的明膠水溶液，明膠與聚乳酸的質量比為1:40，于高速剪切乳化機中10000rpm下混合3～5min，得到乳液；將乳液加至50mL預冷至2℃的質量分數為0.1％的聚乙烯醇溶液中，在800rpm下磁力攪拌3～5min，將乳液分散成微球，收集微球，用去離子水反復清洗多次，真空干燥，即得到多孔聚乳酸微球。

8.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的改良的RPMI-1640培養基組成為：RPMI-1640培養基中添加30～60μMβ-巰基乙醇、0.5～1.5％v/v Ultroser G、0.5～1mg/mL GP4G、50～60ng/mL GFRα1、10～20ng/mL rrGDNF、8～12ng/mL bFGF、50～100U/mL青霉素和50～100μg/mL鏈霉素。

9.根據權利要求8所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的改良的RPMI-1640培養基組成為：RPMI-1640培養基中添加50μMβ-巰基乙醇、1％v/vUltroser G、1mg/mL GP4G、50ng/mL GFRα1、20ng/mL rrGDNF、10ng/mL bFGF、50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素。

10.根據權利要求1所述的體外擴增精原干細胞的3D懸浮培養方法，其特征在于，所述的精原干細胞懸液的制備是將分離純化得到的小鼠精原干細胞用添加了2～5％v/vUltroser G的RPMI-1640培養基重懸獲得。