[發(fā)明專利]一種雙核苷酸條碼報(bào)告基因分析系統(tǒng)、分析方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011313576.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112391473B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃啟來(lái);任乃霞;李博;劉晴晴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué);山東刀火基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12Q1/6869;C12N15/63
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李箏

本發(fā)明具體涉及一種雙核苷酸條碼報(bào)告基因分析系統(tǒng)、分析方法及應(yīng)用?，F(xiàn)有高通量報(bào)告基因分析方法中，核苷酸標(biāo)簽具有偏好性，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供了一種新型的雙核苷酸報(bào)告基因分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用雙核苷酸作為標(biāo)簽，能夠在大大降低偏好性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高通量報(bào)告基因分析。同時(shí)，DiR系統(tǒng)還能通過(guò)定量PCR的方法，結(jié)合標(biāo)簽特異性的引物，在常規(guī)通量水平對(duì)單個(gè)標(biāo)簽的表達(dá)進(jìn)行定量，與傳統(tǒng)熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)相比，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。本發(fā)明通過(guò)所述分析系統(tǒng)對(duì)前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)的基因調(diào)控功能進(jìn)行了分析，經(jīng)篩選確定了多個(gè)功能調(diào)控位點(diǎn)。該DiR報(bào)告基因分析系統(tǒng)在基因調(diào)控活性分析，尤其是疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因變異位點(diǎn)的功能研究方面擁有巨大的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于報(bào)告基因分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙核苷酸條碼報(bào)告基因分析系統(tǒng)、基于該檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)告基因分析方法及其在啟動(dòng)子、增強(qiáng)子分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

這里的陳述僅提供與本公開(kāi)有關(guān)的背景信息，而不必然構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。

全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)提供了一種實(shí)用的方法來(lái)揭示遺傳變異與復(fù)雜疾病之間的關(guān)系。具體而言，GWAS目錄已收錄了5000多種與癌癥相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)，但是，超過(guò)90％的癌癥易感性SNP位點(diǎn)位于基因編碼區(qū)之外，因此這使得對(duì)其功能機(jī)制的研究更具有挑戰(zhàn)性。有報(bào)道表明，大多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)SNP位于DNase I超敏位點(diǎn)(DHS)中，表現(xiàn)出染色質(zhì)開(kāi)放活性，這為其功能機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。通常來(lái)說(shuō)，具有基因調(diào)控功能的風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)通常影響轉(zhuǎn)錄因子在染色質(zhì)上的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因的異常表達(dá)，最終促使了癌癥風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。這些研究表明，風(fēng)險(xiǎn)SNP正在成為轉(zhuǎn)化藥物中癌癥診斷和治療的潛在標(biāo)記物。

為了從大量風(fēng)險(xiǎn)變異位點(diǎn)中篩選出具有基因調(diào)控活性的SNP，本領(lǐng)域迫切需要一種高通量報(bào)告基因分析方法。目前，長(zhǎng)度為10-20nt的DNA標(biāo)簽條碼已被廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的大規(guī)模篩選分析。然而，標(biāo)簽條碼的核苷酸組成會(huì)不可避免地給報(bào)告基因表達(dá)水平帶來(lái)偏倚，因此實(shí)際應(yīng)用中通常需要為每個(gè)調(diào)控元件分配多達(dá)90個(gè)的標(biāo)簽，以減少偏好性對(duì)報(bào)告基因分析結(jié)果的影響。STARR-seq篩選方法是在NGS測(cè)序中使用自轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)作為其自身的標(biāo)簽，用于高通量篩選基因調(diào)控元件，但是僅能用于篩選與位置無(wú)關(guān)的增強(qiáng)子元件。因此，發(fā)明人認(rèn)為，目前仍然缺乏一種不受條碼偏愛(ài)性影響的高通量報(bào)告基因分析系統(tǒng)，無(wú)論基因調(diào)控元件以近距離還是以遠(yuǎn)距離的方式發(fā)揮作用，都能夠準(zhǔn)確評(píng)估其基因調(diào)控活性。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明提供了一種新的、使用雙核苷酸條碼的報(bào)告基因分析系統(tǒng)(DiR-seq系統(tǒng))，以消除條碼標(biāo)簽核苷酸組成帶來(lái)的偏好性。該報(bào)告基因分析系統(tǒng)既可以與二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因表達(dá)的高通量分析。同時(shí)，使用標(biāo)簽特異性的引物，還可以通過(guò)qPCR方法對(duì)單個(gè)標(biāo)簽的表達(dá)在常規(guī)通量水平進(jìn)行定量。與現(xiàn)有的核苷酸標(biāo)簽系統(tǒng)以及熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)相比，DiR-seq系統(tǒng)表現(xiàn)出了更好的一致性，以及更高的靈敏度和穩(wěn)定性。在更好滿足常規(guī)報(bào)告基因分析的同時(shí)，尤其有利于研究風(fēng)險(xiǎn)SNP位點(diǎn)等位基因之間的細(xì)微差異。

進(jìn)一步的，本發(fā)明將DiR-seq應(yīng)用于評(píng)估前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)SNPs的基因調(diào)控功能，鑒定出了多個(gè)功能性風(fēng)險(xiǎn)SNPs位點(diǎn)。這也佐證了本發(fā)明提供的DiR系統(tǒng)表現(xiàn)出更高的準(zhǔn)確性，穩(wěn)定性和靈敏度，不僅可以應(yīng)用于高通量篩選活性，也可以和熒光素酶分析一樣進(jìn)行常規(guī)通量的報(bào)告基因分析，具有極大的潛力，為促進(jìn)各種復(fù)雜疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)SNP的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

基于上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明第一方面，提供一種雙核苷酸條碼報(bào)告基因分析系統(tǒng)，所述分析系統(tǒng)采用雙核苷酸條碼區(qū)別各個(gè)基因調(diào)控元件，所述雙核苷酸條碼的構(gòu)建方法如下：選取一段長(zhǎng)度為400～600bp的DNA序列，去除其中的ATG密碼子并優(yōu)化GC含量至50-60％，所述優(yōu)化后的DNA鏈插入質(zhì)粒載體中作為報(bào)告基因載體質(zhì)粒；

所述優(yōu)化后的DNA鏈中，每個(gè)雙核苷酸位置上設(shè)計(jì)四個(gè)兩兩互異的條碼，即所述雙核苷酸條碼。