[發明專利]CrePR1-P2A與CrePR1-IERS2質粒構建效率的比較方法

在審

• 申請號: 202011311169.0
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112391411A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 林鍇珺
• 申請（專利權）人: 林鍇珺
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 深圳新創友知識產權代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

本發明公開了CrePR1?P2A與CrePR1?IERS2質粒構建效率的比較方法，在細胞系NIH3T3中轉染mROSA?LSL?EGFP質粒，并且同時轉染LScKO?SG?CrePR1?IERS2?tdtomato或LScKO?SG?CrePR1?P2A?tdtomato，在RU486米非司酮誘導下激活PR1孕激素受體，即可激活轉染有兩個質粒的細胞內mTmG體系，從而可以進行P2A與IERS2的質粒效率比較。為研究創造各種Cre酶的轉基因小鼠奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物分子技術領域，涉及利用百奧賽圖質粒的構建與轉染技術來比較P2A，IERS質粒構建效率的方法。

背景技術

IERS2與P2A屬于連接工具片段的連接域，不同的連接域有著不同的效率。由于市場中的工具小鼠大多為CrePR1-IERS2質粒構建，而P2A在市場的工具小鼠非常少。傳統現有技術沒有看到CrePR1-P2A與CrePR1-IERS2質粒構建效率的比較。

順反子是在自然界中是單表達的，如果同時讓基因工程編輯的多個順反子表達，必須要有內部核糖體進入位點(internal ribosome entrysite,IRES)與自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)連接。多個順反子表達可以達到鼠或人的細胞同時表達兩個及以上的基因。Cre基因是基因工程鼠中最常用的工具系統，在細胞核內翻譯成Cre-mRNA,在細胞質翻譯成Cre酶來在細胞核內工作，具有催化活性。Cre酶可以特異性識別loxPDNA識別位點，使得loxP位點識別或重組。Td-tomato是紅色熒光蛋白，其序列可以通過連接序列連接Cre位點，使得申請人在質粒中看到Cre酶的原位表達區域。而本申請可以連接mROSA-LSL-EGFP Vector使得Cre酶看到追蹤的區域，來顯示其表達效率。

發明內容

本發明的目是：為了解決P2A和IERS2在蛋白連接域的效率比較問題。提出一種CrePR1-P2A與CrePR1-IERS2質粒構建效率的比較方法，實現這個問題可以在構建各個轉基因的模式物種(小鼠，大鼠，兔子，猴子等)中發揮非常大的作用。

本發明的技術方案如下：

CrePR1-P2A與CrePR1-IERS2質粒構建效率的比較方法，其特征在于：

在細胞系NIH3T3中轉染mROSA-LSL-EGFP質粒，并且同時轉染LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato或LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato，在RU486米非司酮誘導下激活PR1孕激素受體，即可激活轉染有兩個質粒的細胞內mTmG體系，從而可以進行P2A與IERS2的體系比較。

所述的轉染成功的細胞在溶解有2.33umol/ml RU486藥物米非司酮的二甲亞砜中激活PR1孕激素受體。

進行P2A與IERS2的體系比較后，決定在構建轉基因的蛋白連接域中連接哪一個連接域。通過用膜蛋白中表達mT的新生鼠即mTmG小鼠來分表皮，建立mTmG纖維細胞。

所述細胞系NIH3T3在傳代之后轉染質粒。

本發明所采用的技術方案是與百奧賽圖合作的質粒利用mROSA-LSL-EGFP，LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato和LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato來控制用一定量的RU486來控制表達效率。通過mROSA-LSL-EGFP質粒在Cre酶的激活下才可以實現激活EGFP，所以在細胞系NIH3T3中轉染mROSA-LSL-EGFP質粒，并且同時轉染LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato或LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato，在藥物米非司酮的誘導下可以激活PR1(孕激素)受體。橫向比較P2A與IERS，我們可以決定在構建轉基因的蛋白連接域中連接哪一個連接域。