[發(fā)明專利]一種利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011310367.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN112553361A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳新義;李漢美;劉庭付;吳曉花;汪穎;汪寶根;魯忠富;李國(guó)景
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6869;G16B30/00;G16B20/20
• 代理公司: 北京哌智科創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11745
• 代理人: 宗兵

本發(fā)明公開了一種利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法，包括：步驟一、提取樣品基因組DNA；步驟二、構(gòu)建RAD文庫(kù)，基因組DNA使用EcoRI酶切，利用PCR擴(kuò)增法富集文庫(kù)，采用瓊脂糖凝膠回收目的條帶，單末端進(jìn)行測(cè)序；步驟三、生成原始序列并進(jìn)行序列質(zhì)控分析，根據(jù)序列相似性將高質(zhì)量序列聚類生成RAD?tags，將RAD?tags聚類分群進(jìn)行SNP calling，矯正SNP基因型；步驟四、KASP標(biāo)記開發(fā)與SNP基因分型。本發(fā)明方法利用基因組測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘SNP，不僅可以鑒定出基因表達(dá)區(qū)域的SNP突變，還可以鑒定出基因內(nèi)部和基因間等非編碼區(qū)域的SNP突變，SNP來源更豐富。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法。

背景技術(shù)

蠶豆富含蛋白質(zhì)和纖維素，易被消化和吸收，其干籽粒可做糧食、飼料或加工成休閑食品，鮮籽粒可做蔬菜食用。蠶豆根系具有生物固氮作用，是種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中重要的輪作作物和養(yǎng)地作物。

近年來，隨著第二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展與測(cè)序成本的顯著下降，高通量測(cè)序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥等復(fù)雜、巨大基因組作物的標(biāo)記開發(fā)、基因定位等工作。由基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，即單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)標(biāo)記由于基因組上分布廣泛、密度高、穩(wěn)定性好、適于規(guī)?；Y選等特性，成為新一代理想的分子標(biāo)記，但在蠶豆上，目前公開報(bào)道的SNP標(biāo)記數(shù)目有限。

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序如RAD-Seq(Restriction site-associated DNA sequencing)，是指利用限制性內(nèi)切酶打斷基因組DNA，通過降低基因組的復(fù)雜程度，對(duì)特定片段進(jìn)行高通量測(cè)序以獲得代表目標(biāo)物種全基因組信息的序列數(shù)據(jù)。由于測(cè)序深度適中、成本低而且可以不依賴參考基因組，目前已經(jīng)在多個(gè)非模式物種上廣泛應(yīng)用于標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位等。

而蠶豆為二倍體作物(2n＝2x＝12)，基因組約13Gb，其基因組大小為豆科模式作物苜蓿的25倍，是已知豆科作物中基因組最大的物種之一。蠶豆超大的基因組嚴(yán)重阻礙了全基因組測(cè)序及標(biāo)記開發(fā)等基因組資源研究，使得利用分子標(biāo)記獲取遺傳增益等工作進(jìn)展緩慢，因此，需對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法，以解決蠶豆超大的基因組嚴(yán)重阻礙了全基因組測(cè)序及標(biāo)記開發(fā)等基因組資源研究，使得利用分子標(biāo)記獲取遺傳增益等工作進(jìn)展緩慢的技術(shù)問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

一種利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法，該利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定蠶豆SNP的方法包括以下步驟：

步驟一、取蠶豆幼苗嫩葉作為樣品，液氮研磨后提取樣品基因組DNA；

步驟二、構(gòu)建RAD文庫(kù)，基因組DNA使用EcoRI酶切，利用PCR擴(kuò)增的方法富集文庫(kù)，采用瓊脂糖凝膠回收目的條帶，單末端進(jìn)行測(cè)序；

步驟三、生成原始序列并進(jìn)行序列質(zhì)控分析，去除小于85bp的序列，得到篩選后的序列，并根據(jù)序列相似性將篩選后的序列聚類生成RAD-tags，將RAD-tags聚類分群進(jìn)行SNPcalling，矯正SNP基因型；

步驟四、選擇覆蓋SNP位點(diǎn)、全長(zhǎng)為100bp的序列，設(shè)計(jì)KASP引物，并使得每個(gè)KASP引物標(biāo)記分別包括用于區(qū)分SNP等位變異的兩條正向引物序列和一條通用的反向引物序列，SNP基因分型進(jìn)行SNP信號(hào)檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述步驟一中的蠶豆幼苗嫩葉為生長(zhǎng)1周的蠶豆幼苗嫩葉。

進(jìn)一步地，在所述步驟一中，提取樣品基因組DNA后，還包括：