[發明專利]一種利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法

在審

• 申請號: 202011310367.5
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112553361A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 吳新義;李漢美;劉庭付;吳曉花;汪穎;汪寶根;魯忠富;李國景
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;G16B30/00;G16B20/20
• 代理公司: 北京哌智科創知識產權代理事務所(普通合伙) 11745
• 代理人: 宗兵

1.一種利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法包括以下步驟：

步驟一、取蠶豆幼苗嫩葉作為樣品，液氮研磨后提取樣品基因組DNA；

步驟二、構建RAD文庫，基因組DNA使用EcoRI酶切，利用PCR擴增的方法富集文庫，采用瓊脂糖凝膠回收目的條帶，單末端進行測序；

步驟三、生成原始序列并進行序列質控分析，去除小于85bp的序列，得到篩選后的序列，并根據序列相似性將篩選后的序列聚類生成RAD-tags，將RAD-tags聚類分群進行SNPcalling，矯正SNP基因型；

步驟四、選擇覆蓋SNP位點、全長為100bp的序列，設計KASP引物，并使得每個KASP引物標記分別包括用于區分SNP等位變異的兩條正向引物序列和一條通用的反向引物序列，SNP基因分型進行SNP信號檢測。

2.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟一中的蠶豆幼苗嫩葉為生長1周的蠶豆幼苗嫩葉。

3.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，在所述步驟一中，提取樣品基因組DNA后，還包括：

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的樣品基因組DNA的質量，并使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測所提取的樣品基因組DNA濃度。

4.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟二中，基因組DNA使用EcoRI酶切時，對酶切片段的3'端加‘A’處理，連接MID接頭；單末端測序使用Illumina HiSeq2000平臺。

5.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟三中，原始序列由Illumina base calling軟件CASAVA v1.8.2生成，并使用Trimmomatic軟件在默認參數下進行序列質控分析。

6.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟三中，根據序列相似性使用ustacks軟件將篩選后的序列聚類生成RAD-tags，并使用cstacks軟件在默認參數下將RAD-tags聚類分群進行SNP calling，最后使用貝葉斯算法矯正SNP基因型。

7.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟四中，采用Kraken^TM軟件設計KASP引物。

8.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟四中，SNP基因分型采用IntelliQube高通量基因分型檢測平臺進行SNP信號檢測。

9.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟四中，SNP基因分型進行SNP信號檢測時，單點反應體積為1.6μL，其中樣品DNA 0.8μL，2xMaster mix和Primer mix混合后的體積為0.8μL。

10.如權利要求1所述的利用簡化基因組測序數據鑒定蠶豆SNP的方法，其特征在于，所述步驟四中，SNP基因分型進行SNP信號檢測時，PCR擴增程序為95℃溫度下15min，94℃溫度下20s，61-55℃溫度下60s，共10個循環；94℃溫度下20s，55℃溫度下60s，共26個循環。