[發明專利]一種羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法

在審

• 申請號: 202011309014.3
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN114539398A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 王碩;胡耀中;陸旸;張川;張博崴
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C07K16/16
• 分類號: C07K16/16;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/70;C12N15/13;G01N33/68
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 邢月;張艷梅

本發明提供了一種羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法，包括如下步驟：(1)對質粒和質粒載體進行雙酶切，將得到的VHH基因片段與質粒載體進行連接形成重組質粒，然后將所述的重組質粒電轉化入大腸桿菌感受態細胞中進行納米抗體的表達，純化得到的納米抗體蛋白；(2)雙抗夾心ELISA方法的構建：在捕獲抗體中加入羽扇豆總蛋白，使其與捕獲抗體結合，然后加入檢測抗體，鼠抗HA單克隆抗體為一抗，HRP標記的單克隆抗體為二抗，進行顯色后即成。本發明所述的羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法基于特異性的納米抗體，能夠開發食品中痕量過敏原的高靈敏快速檢測體系，用于食物組分中過敏原檢測。

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，尤其是涉及一種羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法。

背景技術

傳統食物過敏原組分的免疫檢測技術開發基于單克隆或多克隆抗體的篩選與制備，其要求在動物免疫過程中注射高純度過敏原蛋白，并且篩選和制備抗體周期較長。在駝源動物外周血液中天然存在一種重鏈抗體(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，與傳統單克隆抗體相比，重鏈抗體天然缺失輕鏈及重鏈第一恒定區(CH1)。克隆并表達重鏈抗體的重鏈可變區得到重鏈抗體的抗原識別和結合域，稱為納米抗體(Nanobody,Nb)。納米抗體具有與原重鏈抗體相當的結構穩定性及抗原結合活性，是目前已知的可結合靶向抗原的最小抗體單位。針對傳統免疫過程需要制備高純度過敏原蛋白，并且傳統單克隆抗體制備周期長，成本高，與傳統單克隆抗體片段相比，納米抗體存在諸多優勢，納米抗體制備周期短，成本低，穩定性高。納米抗體可溶性極高，不易發生聚集沉淀，具有很高的穩定性，能夠在高溫、強酸、強堿等致變性條件下保持抗原結合活性，適合于原核及真核表達系統。目前，納米抗體被廣泛應用于開發治療性抗體藥物、診斷試劑(膠體金法、酶聯免疫吸附法、電化學發光法)、親和純化基質、免疫學研究等基礎科學研究領域。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在克服現有技術中的缺陷，提出一種羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法，包括如下步驟：

(1)納米抗體的制備及篩選：分別使用限制性核酸內切酶PstⅠ和BstⅡ對質粒和質粒載體進行雙酶切，將得到的VHH基因片段與質粒載體通過T4 DNA連接酶進行連接形成重組質粒，對重組質粒進行純化，然后將純化后的重組質粒電轉化入大腸桿菌感受態細胞中進行納米抗體的表達，純化得到的納米抗體蛋白；

(2)雙抗夾心ELISA方法的構建：在捕獲抗體中加入羽扇豆總蛋白，使其與捕獲抗體結合，然后加入檢測抗體，鼠抗HA單克隆抗體為一抗，HRP標記的單克隆抗體為二抗，進行顯色后即成。

進一步，得到所述的納米抗體蛋白后將帶有His標簽的納米抗體作為捕獲抗體，帶有His和HA標簽的納米抗體作為檢測抗體。

進一步，所述的捕獲抗體的濃度為7.5mg/ml，檢測抗體的濃度為7.5mg/ml。

進一步，羽扇豆總蛋白的最低檢測限為1.15mg/L，定量限為29.75mg/L。

所述的羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法的用途，所述的方法在制備檢測試劑盒中的應用。

相對于現有技術，本發明具有以下優勢：

本發明所述的羽扇豆過敏原Lupan1的夾心ELISA方法基于特異性的納米抗體，能夠開發食品中痕量過敏原的高靈敏快速檢測體系，用于食物組分中過敏原檢測。

附圖說明

圖1為本發明實施例所述的納米抗體純化色譜峰值的曲線圖；