[發明專利]蓋他病毒全長感染性克隆、復制子系統及其制備和應用

在審

• 申請號: 202011308509.4
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112458064A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 韋祖樟;任同偉;莫清榮;閔湘菱;王豪;王玉旭;陳櫻;歐陽康;黃偉堅
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/40;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發明公開了一株GETV毒株(GETV?GX201808株)，發明人以此構建了以細菌質粒為骨架的病毒感染性克隆pGETV?GX，并能成功拯救出病毒；然后將報告基因GFP插入GETV感染性克隆病毒基因組中，成功拯救出能表達該報告基因的重組GETV病毒；同時，還構建并表達報告基因GFP的蓋他病毒復制子系統。本發明為深入研究GETV的基礎和應用研究提供了有效的平臺，利于進一步開展病毒分子生物學特性、復制機制、致病機理等研究，為透徹了解GETV從而開發新型的、安全的、高效的GETV診斷試劑和疫苗提供理論依據。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及蓋他病毒全長感染性克隆、復制子系統及其制備和應用。

背景技術

蓋他病毒(Getah virus,GETV)是一種單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員。甲病毒基因組5ˊ末端的前2/3部分編碼非結構蛋白，稱為非結構區，該區共編碼4種非結構蛋白(nsp1-nsp4)，而靠近3ˊ末端的后1/3稱為結構區，編碼數種結構蛋白，這些結構蛋白由亞基因組mRNA翻譯得到，其包括衣殼蛋白(C)、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6K蛋白等。

研究證明，蓋他病毒可引起賽馬急性發熱，后肢伴有麻疹和腫脹。GETV引起豬的疾病時，幼豬癥狀表現為精神不振、食欲減退或消失、全身震顫、體溫升高、腹瀉、體表發紅、共濟失調等，嚴重者還可出現神經癥狀，甚至衰竭死亡，但是，耐受強的仔豬則無臨床癥狀。懷孕母豬感染蓋他病毒后一般不出現臨床癥狀，但會引起繁殖障礙，導致胚胎死亡并被吸收，從而降低母豬產仔數，妊娠前期感染該病毒可導致胚胎死亡，母豬返情，產死胎等。

1955年首次從馬來西亞雪背庫蚊(Culex gelidus)中分離到該病毒。血清學檢測結果顯示，GETV廣泛分布于歐洲、亞洲和大洋洲，在豬、馬、牛及袋鼠等多種動物體內均檢測到GETV抗體。日本自20世紀70年代以來已多次報告馬和豬中的GETV感染，1990年印度報告馬GETV感染暴發。在中國，自從在海南省首次從蚊蟲中鑒定出GETV以來，一些單位開展在媒介昆蟲、家畜的病毒分離，以及人和動物GETV血清學調查，結果顯示，該病毒迅速傳播，在我國東北、西北、西南以及華中廣大地區的動物和人群血清中檢測到GETV特異性IgM、IgG或中和抗體，并多次在動物中引起疫情，導致家畜感染和致死性疾病。

目前，蓋他病毒已經成為危害畜牧業的一個潛在威脅。我國對蓋他病毒研究起步晚，對其生物學特殊性、致病機理、診斷試劑等研究的還不夠深入。我國尚未報道商品化疫苗的批量生產及使用，國外則有不少報道，如日本用于馬的滅活苗、蓋他-乙腦二聯滅活疫苗，用于豬的弱毒活疫苗，蓋他-乙腦-細小三聯弱毒活疫苗，上述疫苗主要為弱毒苗且多用于馬，但是其保護效率也因為毒株的變異而不一定有很好的保護力。蓋他病毒基因工程疫苗尚未見到報道。

目前，已有多種RNA病毒(如脊髓灰質炎病毒、甲病毒、黃病毒、麻疹病毒、流感病毒等)被改造成病毒載體，其中甲病毒表達載體系統是最成功最具前景的RNA病毒載體。甲病毒載體具有許多優勢，比如該病毒基因組結構更為簡單，載體系統的構建和操作更為容易，病毒本身無廣泛的免疫背景，不存在免疫耐受問題，且可感染分裂期細胞和作為抗原遞呈細胞的樹突狀細胞，可望獲得更好免疫效果。另外，甲病毒載體瞬時表達和基因不整合的特點使其在腫瘤治療性疫苗和一些疾病的基因治療研究中有廣闊的前景，所有這些均使其成為新型疫苗研究的有力工具。以辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒和委內瑞拉馬腦炎病毒為基礎的甲病毒表達系統已經成為研究蛋白表達和蛋白修飾的有用工具，已經利用甲病毒載體對大量的來自病毒、細菌的蛋白和腫瘤抗原進行了表達研究。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供蓋他病毒全長感染性克隆、復制子系統及其制備和應用，為深入開展GETV的基礎和應用研究提供有效的平臺。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

一株蓋他病毒，保藏編號為CCTCC NO：V 202069，命名為豬蓋他病毒GETV-GX201808。