[發明專利]蓋他病毒全長感染性克隆、復制子系統及其制備和應用

在審

• 申請號: 202011308509.4
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112458064A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 韋祖樟;任同偉;莫清榮;閔湘菱;王豪;王玉旭;陳櫻;歐陽康;黃偉堅
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/40;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一株蓋他病毒，保藏編號為CCTCC NO：V 202069，命名為豬蓋他病毒GETV-GX201808。

2.權利要求1所述蓋他病毒的全長感染性克隆，其特征在于為該病毒基因組全長感染性克隆pGETV-GX。

3.根據權利要求2所述蓋他病毒的全長感染性克隆，其特征在于：所述pGETV-GX中病毒全長基因為序列表中SEQ.ID.No.27。

4.權利要求1所述蓋他病毒的復制子系統，其特征在于為pGETV-rep-GFP。

5.根據權利要求4所述蓋他病毒的復制子系統，其特征在于：所述pGETV-rep-GFP中重組病毒基因為序列表中SEQ.ID.No.29。

6.權利要求2或4所述蓋他病毒的全長感染性克隆或復制子系統在制備蓋他病毒診斷試劑或蓋他病毒基因工程疫苗方面的應用。

7.一種蓋他病毒全長感染性克隆、復制子系統的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)GETV-GX201808株基因組全序列的擴增；

(2)pGETV-GX重組質粒的構建；

(3)pGEE3GFP重組質粒的構建；

(4)重組質粒pGETV-GX和pGEE3GFP的拯救；

(5)蓋他病毒復制子系統(pGETV-rep)的構建。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于：

步驟(1)和(2)中，提取GETV-GX201808株的RNA，經過反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，分別用S1-S4擴增片段的引物通過PCR擴增得到S1-S4片段；以pBR322為模板，用PBR332PacⅠ 381F/PBR332Mlu Ⅰ 978R擴增得到A片段，將酶切位點Pac Ⅰ、Mlu Ⅰ通過A片段插入pBR322載體中，得到pBR322-PM；通過引物CmvF/Cmv-X-M-N R擴增CMV片段，將CMV插入pBR322-PM；將S1通過酶切位點插入pBR322-PM，得到pBR322-PM-S1，將S2通過酶切位點插入pBR322-PM-S1，得到pBR322-PM-S12，將S3通過酶切位點插入pBR322-PM-S12得到pBR322-PM-S123，將S4通過酶切位點插入pBR322-PM-S123得到pBR322-PM-S1234，最后通過引物BGH-Mlu Ⅰ-F/BGH-Nru Ⅰ-R擴增BGH，得到片段D，將片段D插入pBR322-PM-S1234得到pGETV-GX；

步驟(3)中，以pGETV-GX為模板，用引物TY G Bstb Ⅰ F、ST-44-GFP-1R，GFP3UTRF、TY GMluI R，擴增得到片段B1、B3片段；用ST-44-GFP-2F、GFP3UTRR擴增GFP得到B2片段，將片段B1、B2、B3通過SOE-PCR得到片段B，將片段B插入pGETV-GX得到pGEE3GFP；

步驟(4)中，pGETV-GX轉染BHK-21細胞后，可拯救親本病毒rGETV-GX；而pGEE3GFP轉染BHK-21細胞后，可拯救重組病毒rGEE3GFP；

步驟(5)中，以pGEE3GFP為模板，用引物TY Swa Ⅰ F，SOE GFP R和SOE GFP F，TY GMluI R擴增出C1與C2片段，將片段C1與C2通過SOE-PCR得到片段C，將片段C與pGEE3GFP同時酶切，將片段C替換插入pGEE3GFP，得到pGETV-rep-GFP，用引物CmvF/SOE G 5utr stru 1R、SOE G 5utr stru 2F/TY SrfI R通過SOE-PCR去除病毒非結構蛋白，構建出輔助質粒pGETV-rep-H。

9.權利要求8所述制備方法的引物組，其特征在于包括序列表中SEQ.ID.No.1至26。