[發(fā)明專利]一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011308095.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112391450A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃震;胡貝;羅光成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué);紐奧維特（成都）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6848
• 分類號(hào): C12Q1/6848;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

本發(fā)明公開(kāi)一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測(cè)方法，包括SEA?PCRDNA或RNA檢測(cè)法，以及SEA?ITA恒溫?cái)U(kuò)增DNA或RNA樣品檢測(cè)法；本發(fā)明建立SEA?PCR檢測(cè)和SEA?ITA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法，通過(guò)修飾底物dNTPαSe或dNTPαS，抑制了檢測(cè)過(guò)程中非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，增加了反應(yīng)的特異性、靈敏度、抗干擾性和準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化了引物的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立了高效的擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)特異性的提高，抑制了檢測(cè)體系的非特異性擴(kuò)增，尤其在低濃度核酸DNA或RNA靶標(biāo)分子的情況下，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，從而在臨床DNA或RNA樣品檢測(cè)上減少了假陽(yáng)性率和假陰性率，增加了檢測(cè)結(jié)果的可信度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)方法領(lǐng)域，尤其涉及一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

核酸檢測(cè)是診斷傳染病、遺傳病和腫瘤等疾病的重要手段，如新冠病毒的檢測(cè)和診斷，核酸檢測(cè)方法主要有兩大類：一類是傳統(tǒng)基于變溫的的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，作為核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，其具有靈敏和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，另一類是反應(yīng)溫度恒定的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Isothermal Amplification,ITA)，與PCR方法相比，它操作步驟簡(jiǎn)單，儀器便宜，不需要專業(yè)人員，不需要特殊設(shè)計(jì)檢測(cè)場(chǎng)所，特別適合即時(shí)快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)(point-of-caretesting,POCT)，也適合于經(jīng)濟(jì)條件差地區(qū)，因此近年來(lái)也受到高度關(guān)注。

為了有效實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)特定目標(biāo)序列，引物序列的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化都是非常必要但又很繁瑣的工作，而這些優(yōu)化經(jīng)常不能得到特異性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，從而導(dǎo)致經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)后，PCR經(jīng)常產(chǎn)生大量非特異性的DNA片段，進(jìn)而降低了反應(yīng)的擴(kuò)增效率，現(xiàn)有的提高PCR反應(yīng)特異性和穩(wěn)定性的方法非常耗時(shí)耗力，而且當(dāng)PCR反應(yīng)涉及到多對(duì)引物時(shí)，如多重PCR，這些策略難以改善PCR反應(yīng)特異性。而對(duì)于恒溫?cái)U(kuò)增來(lái)說(shuō)，因?yàn)闆](méi)有溫度輔助的準(zhǔn)確退火配對(duì)過(guò)程，通常引物濃度較高，其擴(kuò)增常常出現(xiàn)非特異性，無(wú)法很好地應(yīng)用到臨床檢測(cè)中，因此，本發(fā)明提出一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測(cè)方法以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏DNA或RNA核酸檢測(cè)方法，該方法建立SEA-PCR[Se-enhanced specific amplification-PCR(硒增強(qiáng)的PCR，簡(jiǎn)稱硒PCR)或者S-enhanced specific amplification-PCR(硫增強(qiáng)的PCR，簡(jiǎn)稱硫PCR)]和SEA-ITA恒溫?cái)U(kuò)增[Se-enhanced specific isothermalamplification(硒增強(qiáng)的ITA，簡(jiǎn)稱硒ITA)或者S-enhanced specific isothermalamplification(硫增強(qiáng)的ITA,簡(jiǎn)稱硫ITA)]的檢測(cè)方法，即是SEA-PCR檢測(cè)法(變溫策略)和SEA-ITA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法(恒溫策略；例如，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)；通過(guò)修飾底物dNTPαSe或者dNTPαS，抑制了檢測(cè)過(guò)程中非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，增加了反應(yīng)的特異性、靈敏度、抗干擾性和準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化了引物的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化；兩類修飾底物dNTPαSe和dNTPαS可分別使用于DNA聚合反應(yīng)(即單類獨(dú)立使用)，也可以兩類以任何方式混合使用于DNA聚合反應(yīng)(包括RNA反轉(zhuǎn)錄)；本發(fā)明建立了高效的擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)特異性的提高，抑制了低濃度模板下的非特異性擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，從而在臨床樣品檢測(cè)上減少了假陽(yáng)性率和假陰性率，增加了檢測(cè)結(jié)果的可信度。而且在ITA技術(shù)中，由于修飾底物提高了聚合反應(yīng)特異性，故SEA-ITA可以在一定反應(yīng)溫度范圍下進(jìn)行，使其可以更好地應(yīng)用到臨床檢測(cè)中。對(duì)DNA樣品的檢測(cè)可以通過(guò)DNA聚合酶的催化直接進(jìn)行。然而，對(duì)RNA核酸樣品的檢測(cè)可以通過(guò)使用RNA反轉(zhuǎn)錄酶(也是一種DNA聚合酶)，來(lái)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后對(duì)得到的DNA進(jìn)行放大檢測(cè)。