[發明專利]一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法

在審

• 申請號: 202011308095.5
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391450A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 黃震;胡貝;羅光成
• 申請（專利權）人: 四川大學;紐奧維特（成都）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

本發明公開一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，包括SEA?PCRDNA或RNA檢測法，以及SEA?ITA恒溫擴增DNA或RNA樣品檢測法；本發明建立SEA?PCR檢測和SEA?ITA恒溫擴增檢測法，通過修飾底物dNTPαSe或dNTPαS，抑制了檢測過程中非特異性產物的產生，增加了反應的特異性、靈敏度、抗干擾性和準確性，簡化了引物的設計和實驗條件的優化，建立了高效的擴增反應，通過特異性的提高，抑制了檢測體系的非特異性擴增，尤其在低濃度核酸DNA或RNA靶標分子的情況下，提高了檢測的靈敏度和準確性，從而在臨床DNA或RNA樣品檢測上減少了假陽性率和假陰性率，增加了檢測結果的可信度。

技術領域

本發明涉及核酸檢測方法領域，尤其涉及一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法。

背景技術

核酸檢測是診斷傳染病、遺傳病和腫瘤等疾病的重要手段，如新冠病毒的檢測和診斷，核酸檢測方法主要有兩大類：一類是傳統基于變溫的的聚合酶鏈式反應(PCR)，作為核酸檢測的標準方法，其具有靈敏和準確的特點，另一類是反應溫度恒定的等溫擴增技術(Isothermal Amplification,ITA)，與PCR方法相比，它操作步驟簡單，儀器便宜，不需要專業人員，不需要特殊設計檢測場所，特別適合即時快速現場檢測(point-of-caretesting,POCT)，也適合于經濟條件差地區，因此近年來也受到高度關注。

為了有效實施聚合酶鏈式反應檢測特定目標序列，引物序列的設計和反應條件的優化都是非常必要但又很繁瑣的工作，而這些優化經常不能得到特異性的聚合酶鏈式反應擴增，從而導致經過多個循環后，PCR經常產生大量非特異性的DNA片段，進而降低了反應的擴增效率，現有的提高PCR反應特異性和穩定性的方法非常耗時耗力，而且當PCR反應涉及到多對引物時，如多重PCR，這些策略難以改善PCR反應特異性。而對于恒溫擴增來說，因為沒有溫度輔助的準確退火配對過程，通常引物濃度較高，其擴增常常出現非特異性，無法很好地應用到臨床檢測中，因此，本發明提出一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法以解決現有技術中存在的問題。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提出一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏DNA或RNA核酸檢測方法，該方法建立SEA-PCR[Se-enhanced specific amplification-PCR(硒增強的PCR，簡稱硒PCR)或者S-enhanced specific amplification-PCR(硫增強的PCR，簡稱硫PCR)]和SEA-ITA恒溫擴增[Se-enhanced specific isothermalamplification(硒增強的ITA，簡稱硒ITA)或者S-enhanced specific isothermalamplification(硫增強的ITA,簡稱硫ITA)]的檢測方法，即是SEA-PCR檢測法(變溫策略)和SEA-ITA恒溫擴增檢測法(恒溫策略；例如，環介導等溫擴增反應，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)；通過修飾底物dNTPαSe或者dNTPαS，抑制了檢測過程中非特異性產物的產生，增加了反應的特異性、靈敏度、抗干擾性和準確性，簡化了引物的設計和實驗條件的優化；兩類修飾底物dNTPαSe和dNTPαS可分別使用于DNA聚合反應(即單類獨立使用)，也可以兩類以任何方式混合使用于DNA聚合反應(包括RNA反轉錄)；本發明建立了高效的擴增反應，通過特異性的提高，抑制了低濃度模板下的非特異性擴增，提高了檢測的靈敏度和準確性，從而在臨床樣品檢測上減少了假陽性率和假陰性率，增加了檢測結果的可信度。而且在ITA技術中，由于修飾底物提高了聚合反應特異性，故SEA-ITA可以在一定反應溫度范圍下進行，使其可以更好地應用到臨床檢測中。對DNA樣品的檢測可以通過DNA聚合酶的催化直接進行。然而，對RNA核酸樣品的檢測可以通過使用RNA反轉錄酶(也是一種DNA聚合酶)，來對RNA進行反轉錄，然后對得到的DNA進行放大檢測。