[發明專利]一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法

在審

• 申請號: 202011308095.5
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391450A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 黃震;胡貝;羅光成
• 申請（專利權）人: 四川大學;紐奧維特（成都）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

1.一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：包括變溫策略檢測法和恒溫策略檢測法。

2.根據權利要求1所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：所述變溫策略檢測法包括以下步驟：

步驟一：合成并配置引物

先針對待測DNA或RNA靶分子進行引物的設計，再根據引物的設計合成出引物，將其用水溶解，配置成特定濃度使其添加到反應體系后的反應濃度為10nM-100microM；

步驟二：配置脫氧核苷三磷酸混合物

用至少一種dNTPαSe或至少一種dNTPαS，徹底或部分取代與之堿基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按規定濃度混合成dNTP混合物，接著根據試驗需要向反應體系中加入規定量的dNTP混合物；

步驟三：配置SEA核酸檢測反應體系

將PCR緩沖液、至少一個熒光染料或至少一個分子探針、至少一個DNA聚合酶、至少一個正向引物、至少一個反向引物、dNTP混合物、核酸DNA或RNA靶標分子配置成SEA-PCR反應體系，并同時設置陽性對照和陰性對照；

步驟四：反應及產物分析

先將配置好的SEA-PCR反應體系放置于PCR儀，最后進行核酸擴增結果的分析。

3.根據權利要求2所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：在所述變溫策略檢測法的步驟二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一種或多種，來徹底或部分取代與之堿基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按規定濃度混合成dNTP混合物，接著根據試驗需要向反應體系中加入規定量的dNTP混合物。

4.根據權利要求1所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：所述恒溫策略檢測法包括以下步驟：

步驟一：合成并配置引物

先針對待測DNA或RNA靶分子進行引物的設計，再根據引物的設計合成出引物，將其用水溶解，并配置成引物混合物，使其添加到反應體系后的反應濃度為0.01-100microM；

步驟二：配置脫氧核苷三磷酸混合物

用至少一種dNTPαSe或至少一種dNTPαS，徹底或部分取代與之堿基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按規定濃度混合成dNTP混合物，接著根據試驗需要向反應體系中加入規定量的dNTP混合物；

步驟三：配置SEA-ITA恒溫擴增反應體系

將擴增緩沖液、引物混合物、至少一個熒光染料或至少一個熒光探針、dNTP混合物、至少一個DNA聚合酶和核酸靶標分子配置成反應體系，并同時設置陽性對照和陰性對照；

步驟四：反應產物分析

先將配置好的反應體系放置于恒溫儀中，接著在恒溫環境下孵育1-600分鐘，最后進行核酸擴增結果的分析。

5.根據權利要求4所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：在所述恒溫策略檢測法中的步驟二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一種或多種，徹底或部分取代與之堿基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按規定濃度混合成dNTP混合物，接著根據試驗需要向反應體系中加入規定量的dNTP混合物。

6.根據權利要求2所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：所述變溫策略檢測法，在步驟一中，通過在線軟件對引物進行設計，設計的引物包括正向引物和反向引物。

7.根據權利要求2所述的一種基于修飾dNTP的高特異和高靈敏核酸檢測方法，其特征在于：在所述變溫策略檢測法的步驟二中，所述dNTP混合物的濃度均為0.01-100mM。