[發明專利]利用液態熱響應型聚合物EO20

在審

• 申請號: 202011307539.3
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112321704A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 曹學君;萬俊芬;陳曦
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/14
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔;豆欣欣

本發明涉及利用熱響應型聚合物環氧乙烷?環氧丙烷無規共聚物水溶液經溫度誘導形成兩水相分離純化單克隆抗體。本發明通過將EO₂₀PO₈₀與單克隆抗體細胞培養液按照體積比1:3混合均勻，調節pH至9.0，并通過溫度誘導形成兩水相體系，使細胞培養液中的單克隆抗體轉移并富集于下相EOPO中；通過將上相去除，并向其中加入與下相等體積的緩沖液，調節pH至4.5，通過溫度誘導使單克隆抗體由下相EOPO轉移并富集于上相緩沖液中，利用正向萃取與反向萃取實現單克隆抗體的分離純化，通過溫度調節熱響應型聚合物的回收率達97.66％。

技術領域

本發明涉及兩水相萃取技術領域，更具體地，涉及可再生型兩水相萃取技術領域，特別是指利用單一溫敏聚合物構建可回收型兩水相體系在單克隆抗體分離純化過程中的工藝設計與優化。

背景技術

可再生兩水相體系是利用熱響應型聚合物構建兩水相體系，通過將熱響應型聚合物的高效回收，實現兩水相體系的重復再利用。

環氧乙烷(EO)-環氧丙烷(PO)無規共聚物(EOPO)是一種熱響應型聚合物，可根據環氧乙烷與環氧丙烷的比例，調節其親疏水性合成不同濁點的熱響應型聚合物，其中常用包括EO₂₀PO₈₀、EO₃₀PO₇₀、EO₅₀PO₅₀，并可根據分離目標物質的性質選擇合適濁點的EOPO。EOPO水溶液通過溫度誘導可形成兩水相體系，當溫度升高至其濁點上15℃，可形成上、下界面清晰的兩相，而當溫度低于其濁點時，該水溶液為均一溶液，無法形成兩相。兩水相體系可通過對溫敏型聚合物的回收實現該體系的回收再利用。

可再生兩水相體系其含水量高，聚合物可被高效回收，與傳統的有機溶劑萃取相比，該萃取條件溫和，有效避免產品活性的損失。可再生型兩水相體系具有綠色環保、操作安全且不需要進行防火防爆的特點。利用該兩水相體系具有分配系數高，易實現綠色環保分離純化單克隆抗體。

可再生型兩水相萃取技術在生物大分子類藥物生產方面具有獨特優勢與較好的應用前景，但形成可再生型兩水相體系的響應型聚合物合成方法較為復雜，價格昂貴且不利于工業放大，兩種響應型聚合物成相面臨相分離時間過長，且工藝不夠成熟，目前只停留在小試階段，這極大限制了可再生型兩水相體系的發展。

因此，利用單一熱響應型聚合物構建可再生兩水相體系可快速成相，目標物質在該體系中的分配系數高且該熱響應型聚合物可被高效回收，利用綠色環保的方法分離純化單克隆抗體成為本領域亟待解決的問題。

發明內容

本發明主要針對上面的問題，提供了一種熱響應型可再生兩水相體系分離純化單克隆抗體的工藝方法，該兩水相體系成相聚合物為熱響應型EO₂₀PO₈₀，其濁點為27℃，分子量為3KDa，誘導溫度高于其濁點10℃以上可形成兩水相，該聚合物為熱響應型液態聚合物，相較于固態聚合物，該液態聚合物通過改變溶液溫度可被高效回收，易于分相，成相時間短，并可顯著降低單克隆抗體的分離純化成本，易于實現綠色環保分離單克隆抗體的目標，且該技術易于工業放大。

為了實現上述的目的，本發明提供了一種分離純化單克隆抗體的方法，其主要特點是，所述的方法包括：

正向萃取步驟：將EO₂₀PO₈₀與單克隆抗體細胞培養液按照1:3的體積比混合均勻，并調節pH至9.0，靜置于40℃水浴鍋30分鐘后，即可分成上下界面清晰的兩相，取出離心，并將上相萃余液去除；

反向萃取步驟：加入與正向萃取步驟中的下相等體積的25mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系，并加入正向萃取步驟中加入的EO₂₀PO₈₀等體積的水，混合均勻并調節pH至4.5，靜置于40℃水浴鍋，直至形成上下界面清晰的兩相，經過反向萃取，單克隆抗體富集于上相水溶液中。