[發明專利]臍帶間充質干細胞脂質囊泡體的制備方法及其在促進皮膚再生中的應用

有效

• 申請號: 202011307065.2
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112410292B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 張玲潔;曾曉麗;陳麗璇
• 申請（專利權）人: 廣東香雪干細胞再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/51;A61K9/00;A61P17/02;A61P17/16
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及臍帶間充質干細胞脂質囊泡體的制備方法及其在促進皮膚再生中的應用。本發明提供的外泌體的制備方法以切向流超濾技術進行提取，該方法提取獲得的外泌體具有良好的產量和純度，因此具有較高的生理活性，其對角質形成細胞具有良好的保護作用。使角質形成細胞即使在受損的條件下仍能獲得良好的增殖效果。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及臍帶間充質干細胞脂質囊泡體的制備方法及其在促進皮膚再生中的應用。

背景技術

外泌體(exosome)是普遍存在的納米膜囊泡，包含多種蛋白質、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)及微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)等，外泌體通過細胞膜表面信號分子的直接作用、膜融合內容物的胞內調節以及生物活性成分的釋放調節等方式，在細胞間物質轉運及信息傳遞過程中扮演重要角色。其在細胞微環境中的作用越來越被重視，具有廣闊的發展前景，被視為許多生物功能的重要組成部分,具有安全性好、體積小、可工程化等特點，將可能作為細胞治療的替代品。

目前外泌體制備的方法有聚合物沉淀、過濾、尺寸排除色譜、密度梯度離心和磁珠捕獲等，然而這些方法普遍存在耗時長、處理體積小等缺點。作為該領域金標準的超速離心法也存在這樣的問題，包括操作人員的不穩定性、囊泡的破碎和聚集、可擴展性差和純度不足，這很大程度上阻礙了評估外泌體在動物臨床前療效的研究，限制了間充質干細胞在外泌體生產中的應用。在這種情況下，外泌體可擴展性、重現性、安全性和產品純度成為關鍵問題。因此，目前急需一種易于擴展以支持大規模生產外泌體的分離方法。

切向流過濾(Tangential Flow Filtration，TFF)技術是一種可以從大量細胞培養基中濃縮蛋白質或病毒的技術，具有處理體積大、可擴展性強、回收率高等優勢，成為了新近外泌體研究者的關注焦點。它的原理是基于液體在泵的驅動下沿著膜表面相切的方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過膜的表面，將被膜截流的顆粒和大分子物質沖走，避免他們堆積在膜表面，造成膜的堵塞和流速下降。但現有技術中報道的通過切向流過濾方法制備得到的外泌體的生理活性不足，導致其應用受限。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供生理活性更高的外泌體的提取方法，從而使制備獲得的外泌體可以在臨床中應用于制備促進傷口愈合的產品。

本發明提供的臍帶間充質干細胞外泌體的制備方法，以切向流超濾技術進行提取，包括：

步驟1：細胞培養上清液經0～10℃，1000g～3000g離心5～15min；

步驟2：經離心的上清液經0.65μm濾膜過濾，取濾液；

步驟3：所述濾液以截留分子量為100kDa～500kDa的濾膜進行過濾，跨膜壓為6～12psi，流速為6～10mL/min，剪切速率為1500～2500s^-1；

步驟4：液體體積濃縮至所述細胞培養上清液的0.5％～2％后，加入2倍體積的PBS緩沖液繼續濃縮至液體體積為所述細胞培養上清液的1.5％～2.5％，再依次經0.45μm、0.22μm濾膜過濾后，收集含有外泌體的濾液。

本發明實施例中，所述細胞上清液由P3代臍帶間充質干細胞培養獲得，其培養方法包括：以DMEM高糖培養基為培養液，將臍帶間充質干細胞以截留分子量為20kDa、材質為聚砜纖維的3D中空培養筒培養，糖消耗量穩定一周后，每隔2天收集細胞培養上清液。實驗表明，與2D工廠培養法相比，由3D中空纖維培養法制備的TFF-exo具有更顯著的促增殖活性作用。

一些實施例中，步驟1中所述的離心條件為4℃，2000g離心10min。

所述切向流超濾的裝置型號為M1；步驟3所述的濾膜材質為聚醚砜，型號為2。