[發(fā)明專利]一種原位活性R-loop建庫(kù)和檢測(cè)方法以及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011303336.7
• 申請(qǐng)日: 2020-11-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112391443B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚紅杰;李堯益;王新秀;黃賽南
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院;生物島實(shí)驗(yàn)室
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州廣典知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬(wàn)志香;顧書玲

本發(fā)明涉及一種R?loop高通量建庫(kù)和檢測(cè)方法，以及相應(yīng)的試劑盒。所述試劑盒中的融合蛋白由結(jié)合蛋白HBD與MNase核酸酶或Tn5轉(zhuǎn)座酶連接構(gòu)成。本發(fā)明所述所述R?loop高通量建庫(kù)和檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)原位活性R?loop檢測(cè)，并可以提高建庫(kù)效率，降低文庫(kù)背景，提高R?loop檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性，并簡(jiǎn)化R?loop檢測(cè)流程。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種原位活性R-loop建庫(kù)和檢測(cè)方法以及試劑盒。

背景技術(shù)

R-loop(R環(huán))是一個(gè)三鏈的核酸結(jié)構(gòu)，即一條RNA鏈與雙鏈DNA的其中一條鏈結(jié)合，另一條DNA鏈空出與RNA:DNA雜合鏈形成一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在以前，R-loop長(zhǎng)被人們認(rèn)為對(duì)細(xì)胞有害，而且受關(guān)注度比較少。近年來(lái)，作為細(xì)胞基因組上的一個(gè)重要元件，R-loop參與許多生物學(xué)功能，成為表觀遺傳學(xué)的重要研究領(lǐng)域。目前，關(guān)于檢測(cè)R-loop的方法大多基于抗體S9.6的DRIP-seq及DRIP-seq的衍生方法。

DRIP-seq((DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)是一種基于特異識(shí)別DNA:RNA雜合鏈抗體的免疫共沉淀及高通量測(cè)序分析技術(shù)，已被用來(lái)檢測(cè)人、小鼠、酵母等模式生物全基因組水平的R-loop分布。DRIP-seq及DRIP-seq的衍生方法，其流程大致包括：⑴收取細(xì)胞及其他生物學(xué)樣本，提取基因組DNA；⑵用限制性核酸內(nèi)切酶將基因組DNA酶切打斷成一定大小的DNA片段；⑶用抗體S9.6免疫沉淀并富集含R-loop的DNA片段；⑷純化回收DNA片段；⑸通過(guò)不同的建庫(kù)方法構(gòu)建文庫(kù)。但目前的DRIP-seq及DRIP-seq的衍生方法都還存在包括檢測(cè)信號(hào)的分辨率有限和S9.6抗體的特異性不足的缺陷。特別是S9.6除了可以識(shí)別R-loop還可以識(shí)別雙鏈RNA(dsRNA)。而且關(guān)于如何檢測(cè)單細(xì)胞水平的活性R-loop手段比較稀缺。

總體而言，目前已有的R-loop檢測(cè)方法存在一些缺陷，主要包括：1、所用細(xì)胞量多；2、不是原位檢測(cè)；3、缺少鏈特異性信息；4、流程所需時(shí)間長(zhǎng)。

但是，因此建立一種新型的單細(xì)胞活性R-loop檢測(cè)方法，對(duì)研究R-loop的生物學(xué)功能具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在以提供一種R-loop高通量檢測(cè)文庫(kù)和原位活性R-loop的檢測(cè)方法，該方法建庫(kù)效率高，文庫(kù)質(zhì)量好。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種R-loop高通量檢測(cè)文庫(kù)，包括將所述融合蛋白與生物樣本孵育，激活所述融合蛋白進(jìn)行基因組切割，終止反應(yīng)后提取DNA，進(jìn)行建庫(kù)。

或，一種原位活性R-loop檢測(cè)方法，包括以下步驟：

⑴收集并處理生物學(xué)樣本，獲得單細(xì)胞懸液或組織樣本的生物學(xué)樣本；

⑵用緩沖液清洗所述生物學(xué)樣本，加入融合蛋白，使融合蛋白充分結(jié)合后清洗未結(jié)合的蛋白；

⑶激活融合蛋白，充分反應(yīng)獲得被融合蛋白識(shí)別并切割得到的小片段DNA或帶有標(biāo)記的DNA片段；

⑷加入終止液終止反應(yīng)，純化回收DNA片段；

⑸進(jìn)行PCR擴(kuò)增完成文庫(kù)構(gòu)建；

⑹測(cè)序。

在其中一些實(shí)施例中，所述生物樣本包括但不限于未經(jīng)交聯(lián)、固定或冷凍/經(jīng)過(guò)交聯(lián)、固定或冷凍處理的培養(yǎng)細(xì)胞樣本、組織樣本或其他生物樣本。

在其中一些實(shí)施例中，所述建庫(kù)可以自建庫(kù)或者用商用試劑盒建庫(kù)，所用的PCR擴(kuò)增聚合酶用到等溫聚合酶及其他具有鏈置換特性的聚合酶、以RNA為模板的聚合酶或以DNA為模板的聚合酶。

在其中一些實(shí)施例中，所述生物樣本與所述融合蛋白孵育的條件為：4±0.5℃孵育2～12h。