[發明專利]一種原位活性R-loop建庫和檢測方法以及試劑盒

有效

• 申請號: 202011303336.7
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391443B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 姚紅杰;李堯益;王新秀;黃賽南
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;生物島實驗室
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香;顧書玲

1.一種用于制備R-loop高通量檢測文庫的試劑盒，其特征在于，包括融合蛋白，所述融合蛋白的單體為HBD-MNase或HBD-Tn5，所述融合蛋白HBD-MNase的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述融合蛋白HBD-Tn5的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括以下構成的Binding buffer: 10±1mM HEPES，10±1 mM KCl，1±0.1 mM CaCl₂，1±0.1 mM MnCl₂；和/或還包括有Washbuffer：10±1 mM HEPES，150±5mM NaCl，0.5 ±0.05mM spermidine；5±1% Digitonin。

3.一種制備R-loop高通量檢測文庫的方法，其特征在于，使用權利要求1-2任一項所述的試劑盒，包括以下步驟：將所述融合蛋白與生物樣本孵育，激活所述融合蛋白進行基因組切割，終止反應后提取DNA，進行建庫。

4.根據權利要求3所述的制備R-loop高通量檢測文庫的方法，其特征在于，所述生物樣本包括未經交聯、固定或冷凍處理的培養細胞樣本、組織樣本，或經過交聯、固定或冷凍處理的培養細胞樣本、組織樣本。

5.根據權利要求3所述的制備R-loop高通量檢測文庫的方法，其特征在于，所述生物樣本與所述融合蛋白孵育的條件為：4±0.5℃孵育2~12h；和/或加入Ca²⁺或Mg²⁺激活所述融合蛋白。

6.根據權利要求3-5任一項所述的制備R-loop高通量檢測文庫的方法，其特征在于，所述切割反應的條件為：所述融合蛋白的單體為HBD-MNase時，0±0.5℃反應10~35 min；或所述融合蛋白的單體為HBD-Tn5時，37~55℃反應30 min~2h。

7.根據權利要求6所述的制備R-loop高通量檢測文庫的方法，其特征在于，所述切割反應的條件為：所述融合蛋白的單體為HBD-MNase時，0±0.5℃反應20min~30min；或所述融合蛋白的單體為HBD-Tn5時，37~55℃反應45 min~1h。

8.一種非疾病診斷目的原位活性R-loop檢測方法，其特征是，使用權利要求1-2任一項所述的試劑盒，包括以下步驟：

⑴ 收集并處理生物學樣本，獲得單細胞懸液或組織樣本的生物學樣本；

⑵ 用緩沖液清洗所述生物學樣本，加入融合蛋白，使融合蛋白充分結合后清洗未結合的蛋白；

⑶ 激活融合蛋白，充分反應獲得被融合蛋白識別并切割得到的小片段DNA；

⑷ 加入終止液終止反應，純化回收DNA片段；

⑸ 進行PCR擴增完成文庫構建；

⑹ 測序。