[發(fā)明專利]結(jié)核分枝桿菌的分子分型方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011302347.3
• 申請(qǐng)日: 2020-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN112501321B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏子涵;許曄;李慶閣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 中國(guó)貿(mào)促會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 張小勇

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，并具體涉及一種對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分子分型方法。本發(fā)明的方案解決了傳統(tǒng)方案中PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性差、檢測(cè)通量低、對(duì)長(zhǎng)片段分辨率低、結(jié)果判讀困難、人工操作步驟多的難題，能夠?qū)Γ?8％的標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確的VNTR?9分型，對(duì)＞95％的標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確的HV?3分型，僅需對(duì)工作人員進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可進(jìn)行操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，并具體涉及一種對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分子分型方法。

背景技術(shù)

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染導(dǎo)致的傳染病，為最主要的引起死亡的單一感染的原因。結(jié)核病的治療時(shí)間長(zhǎng)、治療費(fèi)用高、治愈率低。

控制結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展需要從兩個(gè)方面入手，首先是快速溯源，及時(shí)切斷傳播途徑，減少新病例的產(chǎn)生；其次是要采取有效的、合理的診療方案，治愈病人，減少繼續(xù)傳播。二者相輔相成，缺一不可。

目前針對(duì)結(jié)核病的診療網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)基本完善，但是，由于分型技術(shù)的復(fù)雜性，溯源分析網(wǎng)絡(luò)仍處于空白階段，數(shù)據(jù)零散。

分子流行病學(xué)方法被廣泛用于研究結(jié)核病的暴發(fā)流行、傳染源的尋找和追蹤等，使人們對(duì)結(jié)核病的傳播規(guī)律有了新的認(rèn)識(shí)。常用的方法有Spoligotyping¹、MIRU-VNTR²、IS6110-RFLP³等，其中以MIRU-VNTR為基礎(chǔ)的方法具有操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，并且該方法的結(jié)果呈數(shù)字化，便于不同實(shí)驗(yàn)室之間比較以及國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，是一種容易大范圍推廣的基因分型方法。

結(jié)核分枝桿菌基因組中存在著一些數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(variable numberof tandem repeat,VNTR)，稱為結(jié)核分枝桿菌散在分布重復(fù)單位(mycobacterialinterspersed repetitive units,MIRU)，即MIRU-VNTR。每個(gè)特定的VNTR位點(diǎn)由兩部分組成：中間的可變區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)。在不同菌體中，可變區(qū)含有一個(gè)以上稱為重復(fù)單元的短序列。一般來(lái)說(shuō)，每個(gè)重復(fù)單元的堿基對(duì)數(shù)目恒定，而串聯(lián)在一起的重復(fù)單元的拷貝數(shù)是可變的，由此導(dǎo)致DNA片段長(zhǎng)度的差異。以MIRU-VNTR為基礎(chǔ)的分型方法依靠與各位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)的特異性引物對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳方法確定擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)度和每一重復(fù)單元的長(zhǎng)度為已知，所以根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度能夠確定重復(fù)單元的拷貝數(shù)⁴。對(duì)來(lái)自不同菌株的同一位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，然后與分子量標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，推算出各菌株在該位點(diǎn)上重復(fù)單元的拷貝數(shù)。將各位點(diǎn)的拷貝數(shù)按照一定順序進(jìn)行排列，即標(biāo)本的分型結(jié)果。

不同國(guó)家和地區(qū)流行菌株的特點(diǎn)是不同的，中國(guó)是結(jié)核病負(fù)擔(dān)最嚴(yán)重的國(guó)家之一，主要的流行菌株為北京型結(jié)核分枝桿菌。已有學(xué)者根據(jù)中國(guó)菌株流行特征篩選出一套高分辨率位點(diǎn)組合，由9個(gè)一線分型位點(diǎn)(VNTR-9)和3個(gè)二線分型位點(diǎn)(HV-3)組成。所有菌株經(jīng)VNTR-9檢測(cè)，VNTR-9成簇(9個(gè)VNTR位點(diǎn)的拷貝數(shù)完全相同)的標(biāo)本繼續(xù)進(jìn)行HV-3檢測(cè)，而單一型菌株則無(wú)需HV-3檢測(cè)⁵。VNTR 9+3分型方案需9或12個(gè)PCR反應(yīng)即可對(duì)一份標(biāo)本進(jìn)行基因分型，與金標(biāo)準(zhǔn)VNTR 24相比，分辨率相當(dāng)?shù)稽c(diǎn)數(shù)少了一半，提高了分型效率、節(jié)約成本，更加適應(yīng)中國(guó)的結(jié)核病疫情狀況。