[發明專利]松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202011299879.6
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112322751A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 于海英;張靜;黃瑞芬;張歆逢
• 申請（專利權）人: 南京耐德高科技有限公司;國家林業和草原局森林和草原病蟲害防治總站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 劉省超

本發明公開的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒及檢測方法，包括擴增引物、擴增酶、10x反應Buffer、熒光比色10x染料、核酸提取試劑，屬于生物檢測技術領域。本發明整個檢測過程可在1小時內完成，靈敏度可在每個反應體系中檢出100拷貝，檢測結果無顯著性差異，具有良好的重復性。檢測結果配合熒光檢測儀器判讀，也可直接肉眼顏色判斷，相較傳統分子檢測方法操作更簡單、高效、精準，更符合“早發現、早報告、早除治、早拔除”松材線蟲病防控要求?？捎糜诟骷壦刹木€蟲病檢測檢疫單位、研究機構及社會服務單位，不僅可在實驗室內完成松材線蟲病檢測檢疫鑒定工作，還可以在戶外實現現場檢測檢疫作業，尤其適用于基層松材線蟲病檢測檢疫部門。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒及檢測方法。

背景技術

松材線蟲病，又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲引起的具有毀滅性的森林病害，是全球森林生態系統中最具危險性、毀滅性的病害，已被我國列入對內、對外的森林植物檢疫對象。入侵我國38年，已擴散至18個省(區、市)、672個縣級行政區，累計致死松樹超過6億株，對我國的松林資源、自然景觀和生態環境造成嚴重破壞，造成了嚴重的經濟和生態損失，形勢十分嚴峻。

目前中國在松材線蟲病檢測鑒定方法研究方面已進行了卓有成效的工作，從傳統檢測到現代分子檢測技術均取得了長足的進步。在20世紀八九十年代，我國學者主要依靠癥狀檢驗、流膠法、化學法和顯色反應等手段判斷寄主的發病情況。此類方法簡便易行，不需要復雜的儀器設備，在科學研究與基層生產中都得到了廣泛的應用。從21世紀初開始，隨著分子生物學技術的發展與應用，松材線蟲檢測、檢疫技術取得了突飛猛進的發展。基于生物化學技術、生物電學技術和生物信息技術的RAPD和PCR等新型檢測工具得以應用，快速檢測試劑盒技術、免疫診斷技術、誘集管捕獲診斷技術等新方法、新技術也應運而生。與傳統方法相比，新技術的開發與應用大大提高了檢疫效率和準確性。然而，目前很多檢驗、檢疫方法由于受到條件和技術的限制，或由于方法尚不完善，離大范圍推廣應用還有一定的距離。目前市面上缺少一種操作簡便、快速高效、可便攜易帶用于現場檢測的手段來應對日益嚴重的松材線蟲病災害。

發明內容

針對上述情況，為克服現有技術的缺陷，本發明提供松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒及檢測方法，該試劑盒具有檢測靈敏度高、特異性好、操作簡單，檢測結果不僅可通過熒光檢測設備直接判讀也可以通過肉眼比色判斷，便于大規模在松材線蟲病防控部門推廣應用，將有力推進松材線蟲病的早期監測預防和控制。

本發明采用的技術方案如下：松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒，包括擴增引物、擴增酶、10x反應Buffer、熒光比色10x染料和核酸提取試劑，所述10x反應Buffer包含KCl 20-30mM、MgSO4 2-10mM、Tris-HCl 10-20mM，所述熒光比色10x染料包含Eva Green，所述核酸提取試劑包含Tris-Hcl 50-200mM、EDTA10-30mM、NaCl 200-500mM、SDS 1-3％，所述擴增引物序列如下：

引物F3：CCTATGACACATTTATTCGTGCTCGTC

引物FIP：CGCCTCTCGGCTTCCATGCG GCGATTGGTGACTTCGGTTGCCG

引物LF：GGAACGACGCGAATCGAACCG

引物B3：CGGCAAGCAGCTGGCTG

引物BIP：CGTGCAACGGTGAAGTC CATCTGTCGGCACGGTAAAACGC

引物LB：GGGTTTCTACGTGCTGTTGTTGAGTT。

優選的，所述擴增酶用量為1U-10U。