[發(fā)明專利]松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒及檢測方法

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• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112322751A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于海英;張靜;黃瑞芬;張歆逢
• 申請（專利權(quán)）人: 南京耐德高科技有限公司;國家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲害防治總站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 劉省超

1.松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒，其特征在于：包括擴增引物、擴增酶、10x反應(yīng)Buffer、熒光比色10x染料和核酸提取試劑，所述10x反應(yīng)Buffer包含KCl 20-30mM、MgSO4 2-10mM、Tris-HCl10-20mM，所述熒光比色10x染料包含Eva Green，所述核酸提取試劑包含Tris-Hcl 50-200mM、EDTA10-30mM、NaCl 200-500mM、SDS 1-3％，所述擴增引物序列如下：

引物F3：CCTATGACACATTTATTCGTGCTCGTC

引物FIP：CGCCTCTCGGCTTCCATGCG GCGATTGGTGACTTCGGTTGCCG

引物LF：GGAACGACGCGAATCGAACCG

引物B3：CGGCAAGCAGCTGGCTG

引物BIP：CGTGCAACGGTGAAGTC CATCTGTCGGCACGGTAAAACGC

引物LB：GGGTTTCTACGTGCTGTTGTTGAGTT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒，其特征在于：所述擴增酶用量為1U-10U。

3.松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)利用所述核酸提取試劑從松材線蟲疫木木屑樣本和線蟲液樣本中提取松材線蟲基因組DNA；

(2)將通過步驟(1)提取的所述松材線蟲基因組DNA作為擴增模板，加入所述松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒中，設(shè)置反應(yīng)程序進行擴增檢測；

(3)使用熒光檢測設(shè)備對通過步驟(2)的擴增檢測結(jié)果進行熒光判讀，也可直接肉眼比色判斷結(jié)果。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)的松材線蟲基因組DNA通過以下步驟得到：

取100mg左右的疫木木屑樣本到1.5mL的Eppendorf管中，加入1mL所述核酸提取試劑，10,000rpm離心30秒，95℃處理5-20分鐘，得到的裂解液即為松材線蟲基因組DNA擴增模板。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)的松材線蟲基因組DNA通過以下步驟得到：

取1mL的線蟲液樣本到1.5mL的Eppendorf管中，10,000rpm離心1分鐘，棄去上清加入100uL所述核酸提取試劑，95℃處理5-20分鐘，得到的裂解液即為松材線蟲基因組DNA擴增模板。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)具體為：

取通過所述步驟(1)制得的松材線蟲DNA擴增模板5ul加入到所述松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒20ul反應(yīng)體系中，反應(yīng)程序為65℃溫度下反應(yīng)40-60分鐘，每1分鐘采集一次熒光信號。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中熒光檢測設(shè)備需要激發(fā)波長497nm，檢測波長520nm。

8.一種松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒的用途，其特征在于：所述松材線蟲核酸快速檢測熒光比色二合一試劑盒用于對單條及以上松材線蟲的檢測。