[發明專利]飛蝗C型清道夫受體基因及其靶向dsRNA與應用

有效

• 申請號: 202011299810.3
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391389B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 張建珍;史學凱;李濤;王艷麗
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/705;C12N15/10;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發明屬于生物技術領域，具體涉及飛蝗C型清道夫受體基因及其靶向dsRNA與應用。本發明提供一種昆蟲特有的C型清道夫受體基因全長序列及其在保護dsRNA中的應用。具體為通過生物信息學方法，從飛蝗轉錄組中獲取C型清道夫受體基因片段，進一步調取獲得序列為SEQ ID NO：1基因全長。依據SEQ ID NO：1，設計并合成該基因的dsRNA，該基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO：7所示序列，將其注射進入飛蝗體腔后可以特異性沉默靶標基因，導致飛蝗血細胞對外源dsRNA的吞噬能力顯著降低，對靶基因的沉默效率顯著提高。由于本發明C型清道夫受體基因僅節肢動物昆蟲特有，哺乳動物等高等生物并不存在，對于害蟲防治具有重要的現實意義，可以為害蟲防治提供新的途徑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及飛蝗C型清道夫受體基因及其靶向 dsRNA的合成及其在保護dsRNA中的應用。

背景技術

飛蝗是一種重要的農業害蟲，主要分布于我國河北、山東、江蘇、廣西等省份，因其取食性廣，繁殖力強，遷飛能力強，對農業生產造成嚴重危害。大量使用化學殺蟲劑防治蝗蟲造成了長期的農藥選擇壓力。一方面，導致飛蝗抗藥性增加，防治成本增高；另一方面，導致環境污染和農藥殘留，引發食品安全隱患。隨著人民生活水平的提高，科學技術的進步，研發新型害蟲防治方法迫在眉睫。

RNA干擾(RNAi)技術可靶向沉默目標基因，造成目標基因功能缺失，該技術為臨床疾病治療和作物害蟲防治提供了新方向。由于該技術對靶基因的高效性、特異性及易操作性等特點，目前在害蟲防治等領域具有潛在的應用價值。通過RNA干擾進行害蟲防治具有如下優點：1)專一性，選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等生物和人類安全；2)環保性，對環境無害，RNA在自然界極易降解，無殘留；3)經濟性，生產成本低，應用廣泛。因此，利用RNA干擾技術開發生物農藥是完全可行性的，目前，已作為第四代新型生物農藥dsRNA 殺蟲劑在美國上市。

然而，由于昆蟲擁有天然免疫系統，保護自身免受外界病原體侵染，因此大大降低dsRNA作為新型生物農藥的應用步伐。清道夫受體基因作為昆蟲免疫系統第一道防控開關，發揮吞噬和清除外源病原體的功能，在昆蟲免疫系統中起著重要作用。C型清道夫受體基因在昆蟲體內特異表達，在高等生物及哺乳動物中并不存在，因此，本發明采用RNA干擾技術，特異沉默C型清道夫受體基因，使新型生物農藥dsRNA殺蟲劑免受被吞噬和降解的命運，大大提升dsRNA 的基因沉默效率，用最低劑量的dsRNA殺蟲劑達到高效的殺蟲效果，大幅提高經濟成本，在飛蝗防治中具有重要作用。

發明內容

針對上述問題本發明首先提供了飛蝗C型清道夫受體基因，然后根據飛蝗 C型清道夫受體基因設計并合成其對應的靶向dsRNA，將該靶向dsRNA注射進飛蝗體腔內后，飛蝗C型清道夫受體基因在mRNA水平的表達顯著降低，進而飛蝗吞噬外源dsRNA的能力顯著減弱。

為了達到上述目的，本發明采用了下列技術方案：

本發明提供了飛蝗C型清道夫受體基因全長序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示序列。

上述飛蝗C型清道夫受體基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示序列。該氨基酸序列是對SEQ ID NO：1進行生物信息學分析后預測得到。生物信息學分析表明飛蝗C型清道夫受體基因編碼763個氨基酸，分子量為82.5KD，理論等電點為9.82。

進一步，所述飛蝗C型清道夫受體基因獲得方法，包括以下步驟：

步驟1，基于飛蝗轉錄組數據庫，搜索搜索其Unigene，經NCBI Blastx分析后，獲得飛蝗C型清道夫受體基因的片段；

步驟2，對步驟1搜索獲得的片段通過GeneDoc軟件進行拼接；

步驟3，根據步驟2的拼接結果，設計并合成對應的上游引物SEQ ID NO： 3和下游引物SEQ ID NO：4；