[發明專利]飛蝗C型清道夫受體基因及其靶向dsRNA與應用

有效

• 申請號: 202011299810.3
• 申請日: 2020-11-19
• 公開（公告）號: CN112391389B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 張建珍;史學凱;李濤;王艷麗
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/705;C12N15/10;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.飛蝗C型清道夫受體基因，其特征在于：該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示序列。

2.權利要求1所述的飛蝗C型清道夫受體基因的獲得方法，其特征在于，通過以下步驟獲得：

步驟1，基于飛蝗轉錄組數據庫，搜索其Unigene，經NCBI Blastx分析后，獲得飛蝗C型清道夫受體基因的片段；

步驟2，對步驟1搜索獲得的片段通過GeneDoc軟件進行拼接；

步驟3，根據步驟2的拼接結果，采用primer premier 5.0軟件設計并合成對應的上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4；

步驟4，提取飛蝗的RNA并反轉錄成cDNA，得到PCR擴增所需模板；

步驟5，采用步驟4獲得的模板和步驟3合成的引物，經PCR擴增反應獲得飛蝗C型清道夫受體基因。

3.權利要求1所述的飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA，其特征在于：所述靶向dsRNA的其中一條的核苷酸序列為SEQ ID NO：5所示序列。

4.權利要求3所述的飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1，按照飛蝗C型清道夫受體基因的核苷酸序列，通過primer premier5.0軟件設計含有T7啟動子的上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7；

步驟2，通過PCR擴增獲得兩端均為T7啟動子的模板DNA片段，經試劑盒純化后體外轉錄合成得到飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA。

5.根據權利要求3所述的飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA的應用，其特征在于：用于保護外源dsRNA。

6.根據權利要求5所述的飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA的應用，其特征在于：所述靶向dsRNA保護外源dsRNA是通過微量進樣器將合成的靶向dsRNA注射進飛蝗體腔內從而敲低C型清道夫受體基因表達水平來實現的。

7.根據權利要求2所述的飛蝗C型清道夫受體基因的獲得方法，其特征在于，所述步驟4中模板制備的過程如下：選取生長健康、大小一致、雌雄各半的5齡飛蝗若蟲直接冷凍于液氮中，隨后置于研缽中進行研磨，依照試劑盒提取RNA，采用M-MLV反轉錄酶將所提RNA反轉錄成第一鏈cDNA，從而獲得PCR反應所需模板。

8.根據權利要求2所述的飛蝗C型清道夫受體基因的獲得方法，其特征在于，所述步驟5中PCR擴增反應的體系為：PrimeSTAR Max Premix,2X 10μL，上下游引物各0.2μL，模板1μL，雙蒸水8.6μL，總體積20μL；反應程序為：98℃預變性10s；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸150s，循環35次。

9.根據權利要求4所述的飛蝗C型清道夫受體基因的靶向dsRNA的合成方法，其特征在于，所述步驟2中PCR擴增反應的體系為：2*taq PCR MasterMix II 25μL,上下游引物各1μL，雙蒸水21μL，cDNA模板2μL，總體積為50μL；反應程序為：94℃預變性1min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循環35次；72℃終延伸7min。