[發明專利]BRAFV600E

在審

• 申請號: 202011299529.X
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112322738A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 鄭仲征;杜可明;袁志陽;徐祥;邵文涵
• 申請（專利權）人: 深圳荻碩貝肯精準醫學有限公司;上海荻碩貝肯醫學檢驗所有限公司;上海荻碩貝肯生物科技有限公司;上海荻碩貝肯基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市恒程創新知識產權代理有限公司 44542
• 代理人: 張小容

本發明提出一種BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒和檢測方法，其中，所述BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒包括特異性的引物一、引物二、探針一和探針二；所述BRAF^V600E突變比例檢測方法包括：利用所述引物一、所述引物二、所述探針一和所述探針二，以ctDNA為模板，進行數字PCR擴增，計算不同熒光通道的核酸拷貝數，獲得BRAF^V600E基因位點的突變比例。本發明BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒和檢測方法，可以克服腫瘤異質性，并有效檢測BRAF^V600E低至0.01％的突變，顯著提高了檢測的準確性與靈敏度。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒和BRAF^V600E突變比例檢測方法。

背景技術

BRAF基因所編碼的絲/蘇氨酸特異性激酶是Ras-Raf-MEK-ERK通路中關鍵激酶，通過激活下游底物MEK發揮信號傳導調節作用。通常BRAF蛋白只在傳遞信號時保持激活狀態，但突變的BRAF蛋白則被持續性激活。BRAF被認為是多種腫瘤發生的驅動基因，其突變導致上述通路異常激活可使多種突變細胞發生腫瘤轉化。BRAF最常見突變形式為第l799位核苷酸T/A突變，導致谷氨酸(V)替換為纈氨酸(E)，約占BRAF基因突變的97％，命名為BRAF^V600E。近年，許多學者在朗格漢斯細胞組織細胞增生癥(Langerhans Cell Histiocytosis，LCH)患者病灶樣本中重復檢測到BRAF基因突變，并認為該突變是LCH發病驅動因子。LCH是一組來源于骨髓的朗格漢斯細胞異常增生，伴有數量不等的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞及多核巨細胞浸潤，引起組織破壞。該病在低齡兒童發病率較高，輕者僅累及皮膚，重者可累及多器官并造成重要臟器功能損害，未經治療的LCH患者病死率高達92.1％。另外，多項研究證實，惡性黑色素瘤、毛細胞白血病、甲狀腺乳頭狀癌、結腸癌等人群中均存在高頻率BRAF^V600E突變。因此，BRAF^V600E突變檢測不僅可以進行腫瘤早篩，腫瘤患者危險分層，更為BRAF突變腫瘤患者靶向藥物使用提供指導。

目前，BRAF^V600E突變檢測主要通過qPCR、一代或二代測序完成，檢測準確性與靈敏度較差。

發明內容

本發明提供了一種BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒和BRAF^V600E突變比例檢測方法，旨在提高對BRAF^V600E突變比例檢測的準確性與靈敏度。

為實現上述目的，第一方面，本發明提出一種BRAF^V600E突變比例檢測試劑盒，包括：

引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探針一，包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分別連接所述核苷酸序列一5’端的熒光基團和3’端的淬滅基團；以及

探針二，包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分別連接所述核苷酸序列二5’端的熒光基團和3’端的淬滅基團。

可選地，所述核苷酸序列一的5’端連接FAM熒光基團，所述核苷酸序列一的3’端連接MGB淬滅基團；所述核苷酸序列二的5’端連接HEX熒光基團，所述核苷酸序列二的3’端連接MGB淬滅基團。

第二方面，本發明還提出一種BRAF^V600E突變比例檢測方法，包括以下步驟：

(1)獲得待測樣品，并提取待測樣品的ctDNA；