[發明專利]兔抗人ApoA1多抗血清的制備方法

在審

• 申請號: 202011296870.X
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112375144A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 高健;陳旭華;汪淵;諶敦華
• 申請（專利權）人: 上海鈸樂詩生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

1.一種制備兔抗人ApoA1多抗血清的方法，包括以下步驟：

(1)免疫動物的選擇：選用體格強健、抗應激能力好、甘油三酯水平為(47±5)mg/dl的10月齡雄性日本大耳兔為免疫動物；

(2)免疫動物的抗應激改善：免疫前3d給予氨基電解多維飲水，維持機體電解質、氨基酸及維生素供應，提升抗應激能力；

(3)ApoA1乳化抗原的制備：將純化的人血清ApoA1抗原4mg 0.1ml、pH7.4 0.01M PBS0.9ml及完全弗氏佐劑1ml經電動攪拌乳化后總體積為2ml，作為初次免疫；相同抗原8mg0.1ml、pH7.4 0.01M PBS 0.9ml及不完全弗氏佐劑1ml經電動攪拌乳化后總體積為2ml，作為第二次免疫；相同抗原10mg 0.1ml、pH7.4 0.01M PBS 0.9ml及不完全弗氏佐劑1ml經電動攪拌乳化后總體積為2ml，作為第三次免疫；相同抗原10mg 0.1ml、pH7.4 0.01M PBS0.9ml經均勻混合后總體積為2ml，作為第四次免疫；相同抗原16mg 0.1ml、pH7.4 0.01MPBS 1.9ml均勻混合后總體積為2ml，作為第五次免疫；相同抗原16mg 0.1ml、pH7.4 0.01MPBS 1.9ml均勻混合后總體積為2ml，作為第六次免疫；

(4)ApoA1免疫程序:

(a)初次免疫對兔實施保定盒保定，于其肩前皮下4個注射點、腹股溝皮下4個注射點及頸背部皮下4個注射點，每只兔平均每個注射點注射150μl乳化后的4mg ApoA1初次免疫抗原；

(b)第二次免疫與初次免疫間隔15d，對兔肩前皮下4個注射點、腹股溝皮下4個注射點及頸背部皮下4個注射點，每只兔平均每個注射點注射150μl乳化后的8mg ApoA1第二次免疫抗原；

(c)第三次免疫與二次免疫間隔第21d，對免疫兔行耳緣靜脈采血，析出血清抗體效價行瓊擴檢測，依據抗體水平及原免疫部位抗原吸收情況決定第三次免疫時間，每只兔平均每個注射點注射150μl乳化后的10mg ApoA1第三次免疫抗原；

(d)第四次免疫與第三次免疫間隔21d，對免疫兔行耳緣靜脈采血，析出血清的抗體效價行瓊擴檢測，依據抗體水平及原免疫部位抗原吸收情況決定第四次免疫時間，免疫抗原為非乳化的10mg ApoA1抗原水劑，每只兔平均每個注射點注射150μl非乳化的10mg ApoA1第四次免疫抗原；

(e)第五次免疫與第四次免疫間隔21d，對免疫兔行耳緣靜脈采血，析出血清抗體效價行瓊擴檢測，依據抗體水平及原免疫部位抗原吸收情況決定第五次免疫時間，免疫抗原為非乳化的16mg ApoA1抗原水劑，每只兔平均每個注射點注射150μl非乳化的16mg ApoA1第五次免疫抗原；

(f)第六次免疫與第五次免疫間隔21d，對免疫兔行耳緣靜脈采血，析出血清抗體效價行瓊擴檢測，依據抗體水平及原免疫部位抗原吸收情況決定第六次免疫時間，免疫抗原為非乳化的16mg ApoA1抗原水劑，每只兔平均每個注射點注射150μl非乳化的16mg ApoA1第六次免疫抗原；

(g)于第6次免疫后15d行耳緣靜脈采血，析出血清抗體效價行瓊擴檢測，血清效價符合目標需求后，于次日空腹8h后行兔心臟基部采血，并放置于37℃靜置1h后置于4℃，待血清完全析出后，使用移液槍吸取上層血清至于離心管中，于3000rpm 15min離心沉淀分離獲得上層抗血清，取上清加入終濃度為0.01％硫柳汞，4℃長期保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(1)選取環境適應性強且免疫力好的日本大耳兔為作為抗人ApoA1的抗血清供體。

3.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(2)使用的ApoA1免疫原由超高速區帶離心法純化制備。

4.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(3)使用多個皮下淺表淋巴附近低劑量多點免疫方法。

5.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(4)免疫效價測定方法為瓊擴檢測。