[發(fā)明專利]一種擴(kuò)增PKD1基因的引物組及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011294989.3
• 申請(qǐng)日: 2020-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112195238B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊敬敏;朱學(xué)萍;王彬;唐嘉婕;高鵬飛;林健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海韋翰斯生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發(fā)明涉及遺傳病基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于擴(kuò)增PKD1基因的PCR引物組，所述PCR引物組包括第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)或第四引物對(duì)中的一對(duì)或幾對(duì)。本發(fā)明的引物組延長(zhǎng)了覆蓋1號(hào)外顯子的擴(kuò)增子長(zhǎng)度，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)1號(hào)外顯子區(qū)域的穩(wěn)定擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了PKD1全部外顯子區(qū)域，及大部分內(nèi)含子區(qū)域；特異性地獲得PKD1基因序列，完全擴(kuò)增不到PKD1的假基因序列；在完全排除假基因干擾的情況下，更加準(zhǔn)確地檢測(cè)PKD1基因的變異，包括已知變異和未知變異。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及遺傳病基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種擴(kuò)增PKD1基因的引物組及試劑盒。

背景技術(shù)

多囊腎(polycystic kidney)又名Potter(I)綜合征、Perlmann綜合征，先天性腎囊腫瘤病、囊胞腎、雙側(cè)腎發(fā)育不全綜合征等，是一種較常見(jiàn)的遺傳性疾病。主要表現(xiàn)為兩側(cè)腎病變進(jìn)展不對(duì)稱，大小有差異，至晚期兩腎可占滿整個(gè)腹腔，腎表面布有很多囊腫，使腎形不規(guī)則，凹凸不平，最終導(dǎo)致終末期腎病。多囊腎按遺傳方式可分為常染色體顯性(成人型)多囊腎病(autosomal dominant polycystickidney disease,ADPKD)和常染色體隱性(嬰兒型)多囊腎病(autosomalrecessive polycystic kidney disease,ARPKD)，其發(fā)病率分別為1/400～1/1 000和1/10000～1/40 000。ADPKD以常染色體顯性方式遺傳。成人型多囊腎主要是由PKD1和PKD2基因突變致病，PKD1中基因突變致病率約85％，而PKD2中基因突變致病率約15％，則PKD1是成人型多囊腎的主要致病基因，PKD1基因編碼的蛋白為多囊蛋白1(PC1)。PKD1基因位于16號(hào)染色體短臂上，基因長(zhǎng)52kb，共有46個(gè)外顯子，PKD1基因在16號(hào)染色體上存在6個(gè)與其同源的假基因，假基因與PKD1基因1-33號(hào)外顯子序列同源性高達(dá)97.7％，大約80％的致病突變發(fā)生在此區(qū)域，常規(guī)的PCR或二代測(cè)序等方法難以特異性地將PKD1真基因靶向富集并檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性往往受到假基因的干擾。而且PKD1部分DNA序列GC含量高，如1號(hào)外顯子區(qū)域GC含量高達(dá)85％，利用PCR擴(kuò)增或NGS等方法檢測(cè)高GC含量的序列難度較高，很多利用PCR技術(shù)檢測(cè)PKD1基因的試劑盒均只對(duì)第2-46號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)法檢測(cè)1號(hào)外顯子內(nèi)的變異。PKD1無(wú)特定的突變位點(diǎn)，突變可能發(fā)生在任何部位，因此，全面地檢測(cè)PKD1基因變異需要檢測(cè)其所有外顯子區(qū)域。

現(xiàn)有的檢測(cè)方法各有缺陷。比如，PKD1有46個(gè)外顯子，分別擴(kuò)增PKD1的每個(gè)外顯子再進(jìn)行一代測(cè)序，需要消耗較高的工作量和成本，并且難以特異性地?cái)U(kuò)增PKD1真基因，結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)受假基因序列的干擾；有文章中雖然無(wú)需分別擴(kuò)增每個(gè)外顯子但是擴(kuò)增PKD1基因過(guò)程中所需要使用的引物組也過(guò)多，方法過(guò)于繁瑣，檢測(cè)效率低。或利用巢式PCR富集PKD1真基因，通常先用幾段長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增PKD1基因，再以長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物為模板，富集PKD1真基因，操作相對(duì)復(fù)雜；或利用二代測(cè)序方法檢測(cè)PKD1，難以特異性地捕獲PKD1真基因，并且二代測(cè)序讀長(zhǎng)較短，真假基因同源性高導(dǎo)致數(shù)據(jù)無(wú)法特異性地進(jìn)行比對(duì)；或利用三代測(cè)序方法檢測(cè)PKD1，成本相對(duì)較高。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種擴(kuò)增PKD1基因的引物組及試劑盒，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供的用于擴(kuò)增PKD1基因的PCR引物組，其特征在于，所述PCR引物組包括以下引物對(duì)中的一對(duì)或幾對(duì)：

1)第一引物對(duì)：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物與核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的下游引物；

2)第二引物對(duì)：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的上游引物與核苷酸序列SEQIDNO:4所示的下游引物；

3)第三引物對(duì)：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的上游引物與核苷酸序列SEQIDNO:6所示的下游引物；