[發明專利]一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法

在審

• 申請號: 202011294310.0
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112195271A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 索玉靜;王藝儒;刁松鋒;韓衛娟;李華威;王麗媛;孫鵬;傅建敏
• 申請（專利權）人: 國家林業和草原局泡桐研究開發中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取柿屬植物個體的DNA；

(2)利用權利要求1所述的上游引物和下游引物對所提取的DNA模板進行PCR擴增；

(3)PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀下拍照；

(4)根據電泳圖中的條帶情況對中國甜柿自然脫澀性狀進行鑒定。

3.根據權利要求2所述的一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定方法，其特征在于，在步驟(1)中：

(1-1)用電子天平迅速稱取0.5g的柿樹幼嫩葉片于研缽中，利用液氮將樣品充分研磨成粉末；

(1-2)迅速轉入盛有預熱至65℃的800μL的溴化十六烷基三甲銨CTAB緩沖液的1.5ml離心管中，65℃水浴提取30min；

(1-3)加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿和異戊醇體積比為24：1，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min，將上清液轉入新的離心管，再次加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min；

(1-4)取上清液于新的離心管后，加入等體積且預冷至-20℃的異丙醇，緩慢搖勻至DNA絮狀沉淀析出；10000rpm離心10min，倒去上清液；

(1-5)用體積分數為70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；

(1-6)室溫放置5min使沉淀物自然風干后，加入預熱至65℃的50μL的TE緩沖液，即得到柿基因組DNA；

(1-4)利用1.0％瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計法檢測DNA樣品的純度和濃度，樣品檢測合格后置于-20℃冰箱保存備用。

4.根據權利要求2所述的一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s，49.4℃退火30s，72℃延伸30s，變性退火延伸共35循環，最后72℃延伸10min。

5.根據權利要求2所述的一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴增體系為25μl，反應組成為12.5μL的2x Taq PCR MasterMix，10μM/L的上游引物和下游引物各0.1μL，基因組DNA模板為100-200ng，最后加入ddH₂O補至25μL。

6.根據權利要求2所述的一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法，其特征在于，在步驟(3)中，電泳分離的條件為：90V 40min，4S Red Plus染色，Marker為DNA分子量標準為100-2000bp；采用BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像儀下拍照。

7.根據權利要求2所述的一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法，其特征在于，在步驟(4)中，電泳凝膠上420bp處顯示1條條帶的對應的個體即為具有自然脫澀性狀的中國甜柿；420bp處無條帶的為不具有自然脫澀性狀的中國甜柿。