[發明專利]一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法

在審

• 申請號: 202011294310.0
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112195271A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 索玉靜;王藝儒;刁松鋒;韓衛娟;李華威;王麗媛;孫鵬;傅建敏
• 申請（專利權）人: 國家林業和草原局泡桐研究開發中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

本發明公開一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法，上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；鑒別方法包括如下步驟：提取柿屬植物個體的DNA；利用所述的上游引物和下游引物對所提取的DNA模板進行PCR擴增；PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀下拍照；根據電泳圖中的條帶情況對中國甜柿自然脫澀性狀進行鑒定。本發明提供的分子標記在分子遺傳上與甜、澀性狀共分離，鑒別準確率達到95％以上，可廣泛用于以完全甜柿為育種目標的早期分子標記輔助育種，可以簡便、快速、高效地應用于柿屬植物的育種實踐。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域。具體地說是一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法。

背景技術

柿(Diospyros kaki Thunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，有“木本糧食”之稱。柿屬植物集食用、藥用、用材及觀賞價值于一體，柿果實營養豐富，風味獨特，可鮮食也可制成柿餅食用，柿蒂、柿根、柿葉等可入藥，清熱解毒、護肝降壓；樹干可以作為建筑用材；柿果成熟后色澤鮮艷、形狀各異，可作為良好的觀賞樹種。

柿根據能否在果實硬食期自然脫澀性可分為完全甜柿和非完全甜柿。完全甜柿包括中國甜柿和日本甜柿，中國甜柿自然脫澀性狀由顯性單基因控制，主要表現為單寧凝固效應，而日本甜柿自然脫澀性狀是由隱性單基因控制，主要表現為單寧稀釋效應。完全甜柿無需人工脫澀即可鮮食，長久以來一直作為柿育種的重要目標，雜交育種是品種改良和種質創新的重要方式，以中國甜柿作為雜交親本更有利于獲得完全甜柿新種質。柿樹童期長，通過雜交獲得的新種質，從幼苗繁育到結果后選育優良品系耗時較長，且所需費用較高。因此，有必要開發與中國甜柿自然脫澀性狀相關的分子標記，將完全甜柿新種質在育苗階段篩選出來，通過高接方法可以快速結果，從而節約時間和成本，加速育種進程，提高了種質創新與利用效率。

現有技術中已有分子標記因擴增片段長度較短導致的對中國甜柿鑒定不穩定、不準確，缺乏高效的PCR引物及PCR擴增條件，使得對中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定存在不準確問題，同時也沒有建立一套實際操作方法。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種高效的早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定準確率高、穩定的早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定方法。

為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物，包括上游引物和下游引物，如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的鑒定方法，包括如下步驟：

(1)提取柿屬植物個體的DNA；

(2)利用上述的上游引物和下游引物對所提取的DNA模板進行PCR擴增；

(3)PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀下拍照；

(4)根據電泳圖中的條帶情況對中國甜柿自然脫澀性狀進行鑒定。

上述一種早期鑒定中國甜柿自然脫澀性狀的引物和鑒定方法，在步驟(1)中：

(1-1)用電子天平迅速稱取0.5g的柿樹幼嫩葉片于研缽中，利用液氮將樣品充分研磨成粉末；

(1-2)迅速轉入盛有預熱至65℃的800μL的溴化十六烷基三甲銨CTAB緩沖液的1.5ml離心管中，65℃水浴提取30min；

(1-3)加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿和異戊醇體積比為24：1，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min，將上清液轉入新的離心管，再次加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min；