[發明專利]一種用于可視化檢測活細胞內腫瘤相關mRNA的DNA四棱錐的制備方法

有效

• 申請號: 202011294095.4
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112280830B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 陳憲;文俊梅;陳果
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明公開了一種用于可視化檢測活細胞內腫瘤相關mRNA的DNA四棱錐的制備方法，該DNA四棱錐由兩條捕獲探針和四條帶有熒光標記的DNA支撐探針經兩步退火反應自組裝而成。當目標不存在時，支撐探針的剛性雙鏈使DNA四棱錐保持張開的三維立體結構；而當目標存在時，目標鏈引發鏈置換反應，捕獲探針離開并捕獲目標。與此同時，DNA四棱錐底邊單鏈則自動折疊形成更穩定的發夾結構，帶動DNA四棱錐的整體空間結構發生變化。標記在DNA四棱錐的底邊兩端的Cy3和Cy5隨著折疊過程而靠近，直至發生熒光共振能量轉移。這項工作提出了可視化檢測細胞中特異性mRNA的另一個維度，也可以為其他許多生物分子的檢測開辟新的途徑。

技術領域

本發明屬于生物傳感技術領域，具體涉及一種用于可視化檢測活細胞內腫瘤相關mRNA的DNA四棱錐的制備方法。

背景技術

腫瘤相關mRNA被廣泛用作揭示惡性腫瘤發生、發展和轉移信息的特異性生物標志物。因此，細胞中腫瘤相關mRNA的檢測對癌癥的早期診斷，治療和預后具有重要意義。迄今為止，人們已經開發了許多方法來檢測這些mRNA，例如Northern-blots、微陣列分析、和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。但是，這些方法不僅費時費力，還需要大量樣本細胞，難以實現單細胞的實時檢測。基于熒光顯微鏡的分子成像技術，具有高選擇性、高分辨率和非侵入性的特點，已逐漸發展為可視化細胞內基因表達的一般策略，為在細胞水平上檢測癌癥提供了一種有效的方法。而基于熒光共振能量轉移（FRET）的熒光比率型檢測方法，可通過信號比率來有效避免產生假陽性結果。因此，將基于FRET的熒光探針與熒光成像技術相結合，已成為生物醫學檢測研究的熱點。

腫瘤標志物C-myc是一種腫瘤發生激活劑，在乳腺癌的發生和發展中起著不可忽視的關鍵作用。本發明將MCF-7乳腺癌細胞中的C-myc mRNA作為待測目標物，來評估DNA嘴巴的響應能力。

發明內容

為解決上述問題，本發明提出的一種用于可視化檢測活細胞內腫瘤相關mRNA的DNA四棱錐的制備方法，通過巧妙設計DNA序列，并經過特定的退火程序自組裝成具有三維立體結構DNA四棱錐，實現非侵入式的細胞內腫瘤相關mRNA可視化檢測，并利用FRET技術的比率型信號檢測方式，有效避免了復雜生物樣本中假陽性信號的產生。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于可視化檢測活細胞內腫瘤相關mRNA的DNA四棱錐，所述DNA四棱錐包括兩條捕獲探針CP和四條帶有熒光標記的DNA支撐探針S1~S4，所述S1~S4引物序列為：

S1: 5'-TCGCT GAGTA AT/Cy3/AAA TCAAC GCCTC AACGT TAGCA AAA GC AAGTGTGGGC ACGCA CACAA AACAC AAATC TG-3'；

S2: 5'-CTATC GGTAG AT/Cy3/AAC GCAGT CAGTG TCAGT CCAGA AAA TA CTCAGCGACA GATTT GTGAA AACAA CTAGC GG-3'；

S3: 5'-CACTG GTCAG AT/Cy5/AAA TCAAC GCCTC AACGT TAGCA AAA CT ACCGATAGCC GCTAG TTGAA AAGGT TTGCT GA-3'；

S4: 5'-CCACA CTTGC AT/Cy5/AAC GCAGT CAGTG TCAGT CCAGA AAA CT GACCAGTGTC AGCAA ACCAA AAGTG TGCGT GC-3'。

上述DNA四棱錐的制備方法包括以下步驟：