[發(fā)明專利]一種多基因聯(lián)合檢測癌癥的試劑盒及其檢測方法

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• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112301132A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱田;應(yīng)建明;王樹;張鵬博
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京錦信誠泰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11813
• 代理人: 胡新瑞

本發(fā)明涉及生物化學(xué)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多基因聯(lián)合檢測癌癥的試劑盒及其檢測方法。其技術(shù)要點(diǎn)如下：包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑包括：酶切體系、非酶切體系、針對多個基因位點(diǎn)的PCR引物、第一輪PCR擴(kuò)增混液、第二輪PCR擴(kuò)增混液、堿性磷酸酶SAP體系和基因甲基化測試劑；其中，PCR引物用oligo設(shè)計，通過調(diào)整引物長度，使溶解溫度Tm等于或高于60℃；基因甲基化測試劑包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH₂?SBA?15、485μL二甲亞砜(DMSO)和485μL緩沖溶液C，終體積為1mL。本發(fā)明通過多個基因甲基化水平的測試，提高癌癥的檢測效率和準(zhǔn)確度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多基因聯(lián)合檢測癌癥的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

甲基化是基因組DNA在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控的一種自然修飾方式，參與基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等過程。越來越多的研究表明，DNA甲基化異常及DNA甲基化模式的改變與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。DNA甲基化已被作為一種有前景的癌癥分子生物標(biāo)志物，為癌癥早期診斷、評估癌癥風(fēng)險、制定治療方案以及預(yù)后判斷等方面提供新的啟示。有關(guān)基因啟動子異常甲基化與癌癥發(fā)生之間的研究，目前主要集中在以下4類基因：抑癌基因(包括Rb、VHL、p16IN K4a、p15INK4b、p14ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A)、DNA修復(fù)基因(MGMT和hMLH1)、腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代謝酶基因(GSTP1)。這些基因涉及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、DNA損傷修復(fù)及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程。幾乎所有的人類癌癥中都存在癌癥相關(guān)基因的異常甲基化。2001年M.Esteller等人對涵蓋了肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等15種癌癥的600個癌癥標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)12個重要的癌癥相關(guān)基因的啟動子在癌組織中發(fā)生了甲基化模式的改變，表明每一類型的癌癥中都同時存在著多種癌癥相關(guān)基因的異常甲基化，而且不同部位的癌癥組織中，各種基因的甲基化發(fā)生頻率是不同的，存在著明顯的基因-癌癥類型相關(guān)性。但是現(xiàn)有的癌癥檢測試劑盒并沒有將甲基化水平與癌癥檢測相結(jié)合，致使癌癥檢測結(jié)果精確度低。

鑒于上述現(xiàn)有的檢測癌癥的試劑盒檢測技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明人基于從事此類產(chǎn)品設(shè)計制造多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗及專業(yè)知識，并配合學(xué)理的運(yùn)用，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種多基因聯(lián)合檢測癌癥的試劑盒及其檢測方法，選用與特定癌癥相關(guān)的多個基因進(jìn)行檢測，根據(jù)E值大小賦值分類，將癌癥樣本分為低甲基化樣本、中甲基化樣本和高甲基化樣本，使癌癥檢測更加精確，有助于分析腫瘤患者預(yù)后、預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)，為腫瘤患者制定治療計劃。經(jīng)過不斷的研究、設(shè)計，并經(jīng)反復(fù)試作樣品及改進(jìn)后，終于創(chuàng)設(shè)出確具實(shí)用價值的本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供一種多基因聯(lián)合檢測癌癥的試劑盒，選用與特定癌癥相關(guān)的多個基因同時進(jìn)行檢測，根據(jù)甲基化E值大小賦值分類，達(dá)到準(zhǔn)確、快速檢測癌癥的目的。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的作用原理是：由于HpaII限制性內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA中的5′-CCGG-3′序列，將未甲基化的DNA切斷，而不改變甲基化的DNA序列。我們將基因組DNA分為兩組：一組用于HpaII酶切，另一組不加HpaII。HpaII組中，非甲基化的基因組DNA被酶切，只有甲基化的基因組DNA可以作為PCR擴(kuò)增的模板。在擴(kuò)增過程中，將熒光標(biāo)記的dNTPs結(jié)合到PCR產(chǎn)物上，在PFP存在的條件下，觸發(fā)有效的FRET，此時得到的FRET比值(I_530nm/I_425nm)僅代表甲基化基因組DNA的產(chǎn)物量。對于非HpaII組，由于體系內(nèi)未添加HpaII，非甲基化的基因組DNA不會被酶切，得到的FRET比值(I_530nm/I_425nm)代表甲基化和非甲基化基因組DNA產(chǎn)物的總量。由此可計算出該基因的甲基化比例，甲基化程度越高，E值越大。