[發明專利]一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202011293545.8
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112301132A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 邱田;應建明;王樹;張鵬博
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院腫瘤醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京錦信誠泰知識產權代理有限公司 11813
• 代理人: 胡新瑞

1.一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于，所述盒體內單獨存放的試劑包括：酶切體系、非酶切體系、針對多個基因位點的PCR引物、第一輪PCR擴增混液、第二輪PCR擴增混液、堿性磷酸酶SAP體系和基因甲基化測試劑；其中，所述PCR引物用oligo設計，通過調整引物長度，使溶解溫度Tm等于或高于60℃；

所述基因甲基化測試劑包括：30μL 1mM PFP、5μL Pd@NH₂-SBA-15、485μL二甲亞砜(DMSO)和485μL緩沖溶液C，終體積為1mL。

2.根據權利要求1所述的一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，所述第一輪PCR擴增混液包括：0.4μM正向引物、0.4μM反向引物、0.6mM MgCl₂、50μM dNTPs、1×GoTaqFlexi緩沖液、0.02U GoTaqDNA聚合酶，反應體系總體積為20μL余量用超純水補足。

3.根據權利要求2所述的一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，所述第二輪PCR擴增混液包括：0.5μM正向引物、0.5μM反向引物、0.6mM MgCl₂、4μM dCTP、4μM dATP、3.5μM dTTP、3.5μM dGTP、0.5μM Fl-dGTP、0.5μM Fl-dUTP、1×HotMasterTaq緩沖液、0.025UHotMasterTaq DNA聚合酶，反應體系總體積為20μL余量用超純水補足。

4.根據權利要求1或2所述的一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，所述酶切體系包含200ng基因組DNA，1×HPAII緩沖液，10mM MgCl₂，10mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸pH 7.0和1mM二硫蘇糖醇，20U HPAII酶，，反應體系總體積為20μL，余量用超純水補足。

5.根據權利要求4所述的一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，所述非酶切體系包含200ng基因組DNA，1×HPAII緩沖液10mM MgCl₂，10mM三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸pH7.0和1mM二硫蘇糖醇，，反應體系總體積為20μL余量用超純水補足。

6.根據權利要求1所述的一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒，其特征在于，所述緩沖溶液C是10mM MgCl₂，10mM三甲基咪唑-偏磷酸和1mM二硫蘇糖醇的混合溶液，其中三甲基咪唑-偏磷酸的pH值是8.0。

7.一種多基因聯合檢測癌癥的試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括如下操作步驟：

S1.提取n個與待測癌癥樣本相關的測試基因，每個待測癌癥樣本基因均分為A組和B組；

S2.針對所述測試基因制備PCR引物；

S3.將A組加入到酶切體系中進行酶切，將B組加入到非酶切體系中；

S4.采用所述PCR引物分別對A組和B組進行第一輪PCR擴增；

S5.分別對A組和B組進行第二輪PCR擴增；

S6.分別對A組和B組消化未反應dNTPs；

S7.對所述步驟S6后的A組和B組進行基于PFP的FRET檢測；利用424nm和530nm處的熒光值計算各樣品的FRET比值(I_530nm/I_424nm)，并按照公式1計算各基因啟動子區域CCGG位點的甲基化水平E，其中，公式1為：

其中，FRET比值_HpaII代表經過HpaII酶切處理后的基因組DNA中，基因啟動子區CCGG位點處I_530nm與I_424nm的比值；FRET比值_non-HpaII代表不經過HpaII酶切處理的基因組DNA中，基因啟動子區CCGG位點處I_530nm與I_424nm的比值；FRET比值_Blank代表對照組的I_530nm與I_424nm的比值；n≥2。