[發明專利]質粒測序方法

在審

• 申請號: 202011289189.2
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN114507903A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 周水榮;孟飛龍;陳飛;牛志杰;錢韻婷
• 申請（專利權）人: 蘇州中科細胞轉化研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長

本發明設計利用多標簽接頭和/或引物對大規模質粒進行TN5建庫的方法和組合物。所述方法包括(1)使用多種轉座體復合物對多種質粒進行片段化處理，(2)任選的混合多種質粒的片段和純化，(3)使用第一連接引物和第二連接引物對片段化產物進行擴增，(4)使用含有測序接頭的第三引物和第四引物對步驟(3)的擴增產物進行擴增，和任選的(5)對步驟(4)的擴增產物進行純化。

技術領域

本發明涉及測序方法，具體涉及大規模、高通量質粒測序方法。

背景技術

質粒(Plasmid)是細菌等微生物染色體之外的一種環形的、裸露的雙鏈DNA分子，其長度從1kb至1000kb不等(Doghaither and Gull,2019)。質粒在二十世紀四五十年代被陸續發現，并于1952年由Joshua Lederberg統一其命名(Lederberg,1952)。隨著DNA限制性內切酶、連接酶等DNA操作工具的發現，1973年，Stanley N.Cohen及其同事開啟了體外重組質粒并利用其作為遺傳操作工具的歷史(Cohen et al.,1973)。從此，質粒成為了基因克隆和表達的基礎工具，并被廣泛應用于生物學、生態學、農業、醫學等相關領域。

從結構上看，質粒序列一般可分為兩部分，即骨架和插入序列。骨架一般包含復制子、抗生素抗性基因等用于在質粒擴增中進行復制和篩選的元件，以及啟動子、增強子、終止子等基因表達元件。這部分序列在不同的質粒中相對固定，可根據轉化細菌、表達細胞的不同以及篩選需要等進行一些有限的選擇。插入序列是指實現質粒特殊功能的元件，一般是蛋白或RNA的編碼基因。這部分序列根據具體需求可插入不同序列，幾乎沒有限制，因此其序列在不同的質粒中是高度多樣的。

作為一種基礎工具，質粒被廣泛使用，并在不同的科研團隊、商業公司中分享和傳播。廣泛的分享與傳播也為質粒的準確性帶來了一些問題。一、骨架上可能存在突變。鑒于質粒骨架序列相對固定，許多質粒在構建之初，其骨架序列并未被完全鑒定，通常僅插入序列被測序鑒定。然而，由于一些骨架被長期的大量使用，而DNA的復制并非絕對準確，部分質粒骨架或已累積未知的突變。二、插入序列不詳。質粒在多個團隊間分享傳播過程中難以避免的會出現信息缺失或混淆，這導致部分質粒的插入序列信息不詳，或信息與實際質粒不匹配。上述問題表明了質粒在分享傳播過程中進行質粒序列再鑒定的重要性。通常質粒序列的再鑒定可以通過對質粒進行測序來解決。對于單個質粒，通常使用桑格測序通過逐段設計引物進行測序，然后拼接以獲得質粒的完整序列。但是該法費用較高，一般每個質粒需要幾十至數百元人民幣；且該法通量低，只能逐個測序，每個質粒又需多次測序；針對未知序列的質粒，該法更為繁瑣，需先設法獲取部分序列，如構建特定片段到已知質粒載體上并測序，再逐步設計引物測序，周期漫長，耗費頗多。當需要進行大量質粒的再鑒定時，桑格測序已難以勝任。鑒于此，我們使用轉座酶Tn5對每個質粒進行打斷并標記，然后借助高通量測序技術可大量并行測序的能力，建立了一種可同時檢測數百至上千個質粒的測序方法，以實現低成本、高通量、快速簡便的質粒序列再鑒定。

發明內容

本發明涉及用于處理多種質粒的方法、組合物和試劑盒，尤其是使用轉座體復合物將質粒斷裂和加標簽的方法和組合物。

本發明提供一種多質粒TN5建庫方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)使用多種轉座體復合物對多種質粒進行片段化處理，其中所述多種轉座體復合物包含TN5轉座酶和含多種核酸序列的多種核酸分子，所述多種核酸序列包含轉座子末端序列和多種標簽序列，所述多種轉座體復合物包含的多種標簽序列不同，

(2)任選的混合多種質粒的片段和純化，

(3)使用第一連接引物和第一連接引物對片段化產物進行擴增，

(4)使用含有測序接頭的第三和第四引物對步驟(3)的擴增產物進行擴增，和

任選的(5)對步驟(4)的擴增產物進行純化。

在一個或多個實施方案中，所述方法包括：