[發明專利]質粒測序方法

在審

• 申請號: 202011289189.2
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN114507903A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 周水榮;孟飛龍;陳飛;牛志杰;錢韻婷
• 申請（專利權）人: 蘇州中科細胞轉化研究院
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長

1.一種多質粒TN5建庫方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)使用多種轉座體復合物對多種質粒進行片段化處理，其中

(1.1)至少一種轉座體復合物包含TN5轉座酶和含第一核酸序列的至少第一核酸分子，和

(1.2)至少一種轉座體復合物包含TN5轉座酶和含第二核酸序列的至少第二核酸分子，

(2)任選的混合多種質粒的片段和純化，

(3)使用第一連接引物和第二連接引物對片段化產物進行擴增，

(4)使用含有測序接頭的第三引物和第四引物對步驟(3)的擴增產物進行擴增，和

任選的(5)對步驟(4)的擴增產物進行純化，

其中，所述第一核酸序列包含第一轉座子末端序列和第一標簽序列，所述第二核酸序列包含第二轉座子末端序列和第二標簽序列，所述第一標簽序列和第二標簽序列不同。

優選地，(1.1)的轉座體復合物包含兩種或更多種所述第一核酸分子，所述兩種或更多種第一核酸分子的核酸序列中的第一標簽序列彼此不同；

優選地，(1.2)的轉座體復合物包含兩種或更多種所述第二核酸分子，所述兩種或更多種第二核酸分子的核酸序列中的第二標簽序列彼此不同。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述第一標簽序列是NNNNNNNN，各N獨立地為A、T、G或C；優選地，所述第一標簽序列選自TATAGCCT、ATAGAGGC、TCGCCTTA、CTAGTACG、TTCTGCCT、GCTCAGGA、AGGAGTCC、CATGCCTA、GTAGAGAG、CCTCTCTG，和/或

所述第二標簽序列是NNNNNNNN，各N獨立地為A、T、G或C；優選地，所述第二標簽序列選自CGAGTAAT、TCTCCGGA、AGCGTAGC、CAGCCTCG、TGCCTCTT、TCCTCTAC、ATCACGAC、ACAGTGGT、CAGATCCA、ACAAACGG、ACCCAGCA、AACCCCTC、CCCAACCT、CACCACAC，和/或

所述第一轉座子末端序列和所述第二轉座子末端序列中任一或二者是AGATGTGTATAAGAGACAG。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，

所述第一核酸序列的部分序列與所述第一連接引物的部分序列相同；所述第二核酸序列的部分序列與所述第二連接引物的部分序列相同，或

所述第一連接引物的部分序列與含有測序接頭的第三引物的部分序列相同；所述第二連接引物的部分序列與含有測序接頭的第四引物的部分序列相同，或

所述第一核酸序列的部分序列與所述第一連接引物的部分序列相同，所述第一連接引物還含有與含有測序接頭的第三引物的部分序列相同的序列；所述第二核酸序列的部分序列與所述第二連接引物的部分序列相同，所述第二連接引物還含有與含有測序接頭的第四引物的部分序列相同的序列。

4.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法具有選自以下一項或多項的特征：

所述測序接頭包含第三標簽序列NNNNNN，各N獨立地為A、T、G或C；優選地，第三標簽序列選自TGCCGA、CTTCGA，

所述第一核酸序列如SEQ ID NO:1所示，

所述第二核酸序列如SEQ ID NO:2所示，

所述第一連接引物如SEQ ID NO:3所示，

所述第二連接引物如SEQ ID NO:4所示，

所述第三引物如SEQ ID NO:5所示，

所述第四引物如SEQ ID NO:6所示，

所述方法還包括在(3)所述的擴增前的填充缺口和連接切口步驟，

步驟(2)的純化是純化200bp至500bp的片段。

5.由權利要求1或2所述的方法制備的質粒DNA文庫。