[發明專利]快速鑒別海馬多鞭丸中五種動物藥材的分子生物學方法

有效

• 申請號: 202011288860.1
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN114507741B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 耿福能;姜順日;耿越飛;高潔;劉彬
• 申請（專利權）人: 沈陽清宮藥業集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
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本發明屬于生物技術領域，具體公開了一種快速鑒別海馬多鞭丸中五種名貴動物中藥材海馬、鹿茸、雀腦、蛤蚧和牛鞭的各自特異性引物。本發明還公開了一種快速分別鑒別海馬多鞭丸中五種名貴動物藥材海馬、鹿茸、雀腦、蛤蚧和牛鞭的分子生物學方法，即運用某一特異性引物，以海馬多鞭丸樣品（DNA）為一次PCR反應的模板，并以一次PCR反應產物作為二次PCR反應的模板，擴增得到某一特異片段進而特異鑒別某一味藥材。本發明可以準確、快速鑒定海馬多鞭丸中的名貴藥材，為其質量提供保障。

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種快速鑒定海馬多鞭丸中五種動物藥材（海馬、鹿茸、雀腦、蛤蚧和牛鞭）的分子生物學方法。

背景技術

海馬多鞭丸（國藥準字Z21021322）收載于《衛生部藥品標準-中藥成方制劑》中，該制劑由海馬、蛤蚧、韭菜子、鎖陽、鹿茸（去毛）、補骨脂（制）、小茴香（制）、菟絲子、沙苑子等34味藥原粉入藥組成。具有補腎壯陽，添精增髓的功效。臨床上用于氣血兩虧，面黃肌瘦，夢遺滑精，早泄，陽痿不舉，腰腿酸痛。

目前海馬多鞭丸的鑒別（WS₃-B-2607-97）標準主要采取顯微鏡觀察的方式進行，主要對成品中的淀粉粒、種皮表皮細胞形狀和直徑大小及纖維情況進行鑒別。但是形態學方面藥材部位特征簡單，準確鑒定較為困難；同時由于海馬多鞭丸中存在34味中藥材，通過顯微鏡觀察的方式很顯然無法實現對所有的藥材進行鑒別，特別是對其中的一些貴細藥材海馬、鹿茸和蛤蚧無法進行有效地鑒別。貴細藥材由于本身野生資源匱乏，來之不易，物稀量少、療效顯著，因而價值極高，市場上出現偽品和混淆品較多。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統顯微鏡觀察鑒別方法的缺陷。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術具有靈敏度高、特異性強、高速快速等特點，再加上特異性引物可擴增得到物種特異性的條帶，用此檢測方法可不受形態的控制。

近年來雖然PCR技術在海馬、鹿茸、蛤蚧等及其偽品的鑒定方面得到了廣泛運用，但缺乏從復方中成藥中（包含多種不同動物藥材）鑒定某一種動物藥材方面的研究。本發明即提供了一種高效便捷的分子檢測方法，利用特異性引物，根據預期DNA條帶的有無來鑒定海馬多鞭丸中5種動物藥材，可以準確、快速鑒定海馬多鞭丸中的名貴動物藥材，為其質量提供保障。

發明內容

本發明的目的是提供特異性引物鑒定海馬多鞭丸中5種動物藥材（海馬、鹿茸、雀腦、蛤蚧和牛鞭）、含有其的試劑盒及應用。

為了實現本發明目的，本發明根據海馬、梅花鹿或馬鹿、麻雀、蛤蚧和牛的線粒體DNA序列，設計篩選得到五對特異性引物，其包括：

1）海馬特異性Cytb引物，其特征在于，其序列是：

正向引物1F: 5’-TGCCCTTGTAGACCTSCCT-3’；

反向引物1R: 5’-GCAAATRTGTGTTACTGAAGAGAA-3’

2）鹿茸特異性Cytb引物，其特征在于，其序列是：

正向引物2F: 5’-GCAAACGGGGCATCAAT-3’；

反向引物2R: 5’-AAGCAGGTCTGGTGCGAAT-3’

3）雀腦特異性COI引物，其特征在于，其序列是：

正向引物3F: 5’-GCTACTCACCGACCGCAA-3’；

反向引物3R: 5’-TTATAGTGGCGGATGTGAAGTAG-3’

4）蛤蚧特異性Cytb引物，其特征在于，其序列是：

正向引物4F: 5’-ATCCGAGATGTCCACTA-3’；

反向引物4R: 5’-AAGTATGGGTGAAATGG -3’