[發明專利]一種靶向HER2的CAR-T表達載體及其構建和應用

在審

• 申請號: 202011287019.0
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112391414A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 王春梅;夏容華;曹雪濤
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/62;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 趙徐平

本發明公開了一種靶向HER2的CAR?T表達載體，包含靶向HER2的嵌合抗原受體基因序列；靶向HER2的嵌合抗原受體包括依次連接的：CD8α信號肽、靶向HER2的單鏈抗體、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜區、共刺激因子4?1BB、CD3ζ胞內信號肽、P2A連接肽、PD1信號肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞質信號域。將本發明CAR?T表達載體轉導T淋巴細胞獲得的CAR?T細胞對HER2陽性腫瘤細胞具有顯著的抑制效果。

技術領域

本發明涉及生物技術和醫學技術領域，更具體的說是涉及一種表達PD1CD28嵌合分子、靶向HER2的CAR-T表達載體及其構建和應用。

背景技術

人表皮生長因子受體2(HER2)是一種受體酪氨酸蛋白激酶，其過表達對于腫瘤的發生、發展與轉移起著關鍵性作用。自1998年FDA批準曲妥珠單抗以來，特異性單克隆抗體治療改變了HER2陽性腫瘤的治療，在化療中加入曲妥珠單抗可降低死亡率延長生存期，并降低20％的死亡風險。然而，一些HER2陽性腫瘤患者用藥后并沒有取得良好效果或者漸漸產生耐藥反應；因此，需要進一步研究新的方法來治療HER2過表達的腫瘤患者。

嵌合抗原受體(CAR)T細胞治療對腫瘤的殺傷因不受MHC的限制，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環境，打破宿主免疫耐受狀態，在治療腫瘤方面具有獨特的優勢。研究表明，HER2在人類正常機體組織中不表達或微量表達，而30％以上的腫瘤組織中會過量表達，且位于細胞表面，易被抗體識別，可作為腫瘤特異性CAR-T細胞治療的理想靶點。CAR-T細胞通過靶向識別腫瘤細胞表面抗原，特異性殺傷腫瘤細胞目前在血液腫瘤中取得了較好的臨床效果，但在實體瘤治療中面臨諸多挑戰。實體腫瘤內免疫抑制性的微環境及其他機制和因素抑制CAR-T細胞的激活和功能。因此，如何減少CAR-T細胞在免疫抑制性微環境中的失能，增強其抗腫瘤能力，對實體腫瘤的細胞免疫療法具有重要意義。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種靶向HER2的CAR-T表達載體，其包含PD1胞外區(PD1信號肽、PD1胞外域)、CD28的跨膜域和CD28胞質信號域(活化信號)，通過構建HER2/PD-1/CD28 CAR結構，使用CD28胞內活化基因序列取代PD-1胞內介導抑制信號的結構域，在PD1與其腫瘤高表達的相應配體PD-L1結合時，介導活化信號，而非抑制性信號，使T細胞充分活化，增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷，從而提高CAR-T免疫療法抗腫瘤效果。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種靶向HER2的CAR-T表達載體，包含靶向HER2的嵌合抗原受體基因序列；

靶向HER2的嵌合抗原受體包括依次連接的：CD8α信號肽、靶向HER2的單鏈抗體、CD8α鉸鏈區、CD8α跨膜區、共刺激因子4-1BB、CD3ζ胞內信號肽、P2A連接肽、PD1信號肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞質信號域。

PD-1/PDL1信號通路會抑制CAR-T細胞的激活和功能，本申請在CAR-T表達載體中引入PD1信號肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞質信號域，將PD-L1與PD-1結合誘發的T細胞抑制性信號轉換為CD28傳遞的活化信號，可減少CAR-T細胞在免疫抑制性微環境中的失能，從而增強其抗腫瘤能力。

優選地，CD8α信號肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

靶向HER2的單鏈抗體輕鏈VL核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

靶向HER2的單鏈抗體鉸鏈Linker核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

靶向HER2的單鏈抗體重鏈VH核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

CD8α鉸鏈區核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

CD8α跨膜區核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；