[發(fā)明專利]細(xì)胞色素P450突變體蛋白及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011285843.2
• 申請(qǐng)日: 2020-11-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114507646A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周志華;李曉東;王平平;嚴(yán)興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12P33/06
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素P450(CYP716A53v2)突變體蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的突變研究，確定了與CYP716A53v2酶的催化活性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，通過(guò)進(jìn)行定點(diǎn)改造，獲得酶催化活性的大大提高的CYP716A53v2突變體。本發(fā)明還提供了表達(dá)所述突變體基因工程細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和天然產(chǎn)物藥物等領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞色素P450(CYP716A53v2)的突變體蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人參皂苷是五加科人參屬植物(如人參、三七、西洋參等)中的主要活性物質(zhì)，近年來(lái)在葫蘆科植物絞股藍(lán)中也發(fā)現(xiàn)一些人參皂苷。目前，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)從人參、絞股藍(lán)等植物中分離出了至少100多種人參皂苷，這些皂苷在人參中的含量差別非常大。其中一些療效顯著的三萜皂苷在天然總皂苷中含量極低(亦被稱為稀有皂苷)，由于提取的成本很高，所以價(jià)格就非常昂貴。目前多種皂苷已經(jīng)應(yīng)用于藥品和保健品，如以人參皂苷Rg3單體為主要成分的藥物參一膠囊可改善腫瘤患者的氣虛癥狀，提高機(jī)體免疫功能；以人參皂苷Rh1等16種稀有人參皂苷混合物為主要成分的瑞得生膠囊可以抑制腫瘤部位新生血管生成，促進(jìn)癌變細(xì)胞凋亡，并降低化療耐藥。

由于稀有人參皂苷往往具有獨(dú)特生物活性或更顯著療效，傳統(tǒng)制備稀有人參皂苷都是從人參或三七中提取的大量皂苷經(jīng)過(guò)化學(xué)水解法、酶法水解和微生物法水解來(lái)制備。由于野生的人參資源已基本耗竭，人參總皂苷資源目前主要來(lái)源于人參或三七的人工栽培，而其人工栽培的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)(一般需要5-7年以上)，并且受到地域的限制，還經(jīng)常受到病蟲(chóng)害而需要施用大量的農(nóng)藥，并且人參或三七的人工栽培有嚴(yán)重的連作障礙(人參或三七種植地需要休耕5-15年以上才能克服連作障礙)，所以人參皂苷的產(chǎn)量、品質(zhì)及安全性都面臨挑戰(zhàn)。另一方面，以人參總皂苷為原料來(lái)制備單一成分的皂苷，因?yàn)榭傇碥罩羞€有大量的成份無(wú)法轉(zhuǎn)化為目標(biāo)人參皂苷單體(例如原人參三醇型皂苷)無(wú)法得到利用，不僅造成資源的浪費(fèi)，還會(huì)增加抽提純化成本。

合成生物學(xué)的發(fā)展為植物來(lái)源的天然產(chǎn)物的異源合成提供了新的機(jī)遇。以酵母為底盤，通過(guò)代謝途徑的組裝和優(yōu)化，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了用廉價(jià)的單糖來(lái)發(fā)酵合成青蒿酸或者雙氫青蒿酸，繼而再通過(guò)一步化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)青蒿素，這表明合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物的藥物合成方面具有的巨大潛力。利用酵母底盤細(xì)胞通過(guò)合成生物學(xué)方法異源合成稀有人參皂苷單體，原料為廉價(jià)的單糖，制備過(guò)程為安全性可調(diào)控的發(fā)酵過(guò)程，避免了任何外來(lái)污染(例如，原料植物人工種植時(shí)使用的農(nóng)藥)，因此，通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)制備稀有人參皂苷單體，不僅具有成本優(yōu)勢(shì)，而且，可以保證成品的品質(zhì)與安全性。利用合成生物學(xué)技術(shù)制備足夠量的各種高純度稀有人參皂苷單體，用于活性測(cè)定及臨床實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)稀有人參皂苷的創(chuàng)新藥物研發(fā)。