[發明專利]細胞色素P450突變體蛋白及其應用

在審

• 申請號: 202011285843.2
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN114507646A
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 周志華;李曉東;王平平;嚴興
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12P33/06
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種提高細胞色素P450 CYP716A53v2的催化活性的方法，包括：對細胞色素P450CYP716A53v2的氨基酸序列進行突變，對應于野生型細胞色素P450 CYP716A53v2，突變選自下組的位點或其組合：第167位，第451位，第117位，第208位。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，第167位突變為Val，第451位突變為Asn，第117位突變為Ser，第208位突變為Cys。

3.一種細胞色素P450 CYP716A53v2突變體，其是：

(a)氨基酸序列對應于野生型細胞色素P450 CYP716A53v2，選自下組的位點或位點組合發生突變的蛋白：第167位，第451位，第117位，第208位；

(b)將(a)蛋白的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于野生型細胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；

(c)與(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但對應于野生型細胞色素P450 CYP716A53v2的第167位，第451位，第117位，第208位的氨基酸與(a)蛋白相應位置突變后的氨基酸相同；

(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加標簽序列，或在其N末端添加信號肽序列或分泌信號序列后形成的多肽。

4.如權利要求3所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體，其特征在于，第167位突變為Val，第451位突變為Asn，第117位突變為Ser，第208位突變為Cys。

5.如權利要求3或4所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體，其特征在于，所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體包括選自下組的蛋白：對應于野生型細胞色素P450CYP716A53v2，

(1)第117位突變為Ser、第451位突變為Ala；

(2)第117位突變為Ser、第208位突變為Cys、第167位突變為Val、第451位突變為Ala；

(3)第117位突變為Ser、第208位突變為Cys；

(4)第117位突變為Ser、第208位突變為Cys、第451位突變為Ala；

(5)第167位突變為Val；

(6)第451位突變為Ala；

(7)第117位突變為Ser；

(8)第208位突變為Cys。

6.分離的多核苷酸，其特征在于，所述的核酸是編碼權利要求3～5任一所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體。

7.一種載體，其特征在于，它含有權利要求6所述的多核苷酸。

8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求7所述的載體，或基因組中整合有權利要求6所述的多核苷酸。

9.如權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為真核細胞或原核細胞；較佳地，所述真核細胞包括：酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、霉菌細胞、哺乳動物細胞；更佳地，所述的酵母細胞包括：釀酒酵母細胞或畢赤酵母細胞；更佳地，所述的植物細胞包括：人參細胞；較佳地，所述的原核細胞包括：大腸桿菌、枯草桿菌細胞。

10.一種權利要求3～5任一所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體的制備方法，包含：

(i)培養權利要求8所述的宿主細胞；

(ii)收集含有權利要求3～5任一所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體的培養物；

(iii)從培養物中分離出所述的細胞色素P450 CYP716A53v2突變體。