[發(fā)明專利]一種EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011285344.3 | 申請日： | 2020-11-17 |
| 公開（公告）號： | CN112210606A | 公開（公告）日： | 2021-01-12 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王雨倩;徐梅波 | 申請（專利權(quán)）人： | 遠(yuǎn)辰生物科技（蘇州）有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6886 | 分類號： | C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 蘇州吳韻知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32364 | 代理人： | 王銘陸 |
| 地址： | 215000 江蘇省蘇州市工業(yè)園區(qū)金*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 egfr t790m 數(shù)字 pcr 檢測 體系 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，包含引物探針混合物，其特征在于，所述引物探針混合物由一對檢測EGFR T790M位點的特異性引物和一對檢測EGFR T790M位點的特異性探針組成：
(1)所述特異性引物包括：
EGFR T790M正向引物：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’，
EGFR T790M反向引物：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3’；
(2)所述特異性探針包括：
EGFR T790M野生型探針：5’-TGAGCTGC
EGFR T790M突變型探針：5’-TGAGCTGC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針5’端具有VIC熒光基團(tuán)修飾，突變型探針5’端具有FAM熒光基團(tuán)修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針和突變型探針的3’末端經(jīng)過雙脫氧修飾、氨基修飾或磷酸化修飾以阻斷探針在擴(kuò)增過程中延伸；優(yōu)選地，所述探針的3’末端位修飾MGB非熒光淬滅基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針和突變型探針的核苷酸序列中下劃線標(biāo)注的核苷酸為經(jīng)過修飾以增強(qiáng)所述探針與互補(bǔ)鏈的熱穩(wěn)定性的核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述經(jīng)過修飾以增強(qiáng)所述探針與互補(bǔ)鏈的熱穩(wěn)定性的核苷酸為鎖核酸修飾的核苷酸或者肽核酸修飾的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述經(jīng)過修飾以增強(qiáng)所述探針與互補(bǔ)鏈的熱穩(wěn)定性的核苷酸為鎖核酸修飾的核苷酸：
EGFR T790M野生型探針：5’-TGAGCTGC/iXNA_G/TGATGAG-3’，
EGFR T790M突變型探針：5’-TGAGCTGC/iXNA_A/TGATGAG-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述檢測體系由10*引物探針混合物、ddPCR-酶反應(yīng)液、模板DNA和去離子水組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系，其特征在于，所述引物探針混合物的濃度分別為：
EGFR T790M正向引物濃度為4.5-10.0μmol/L；
EGFR T790M反向引物濃度為4.5-10.0μmol/L；
EGFR T790M野生型探針濃度為3.5-6.0μmol/L；
EGFR T790M突變型探針濃度為3.5-6.0μmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測體系用于檢測血漿游離DNA EGFR T790M位點突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的EGFR T790M位點的數(shù)字PCR檢測體系的應(yīng)用，其特征在于，檢測血漿游離DNA EGFR T790M位點突變方法包括如下步驟：
(1)提取血漿樣本的游離DNA；
(2)采用由10*引物探針混合物、ddPCR-酶反應(yīng)液、模板DNA和去離子水組成的檢測體系配制擴(kuò)增反應(yīng)；
(3)按照如下擴(kuò)增條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃熱啟動，10分鐘；94℃變性，30秒；60-62℃退火，60秒；擴(kuò)增40個循環(huán)；98℃酶失活，10分鐘；4℃保溫，反應(yīng)結(jié)束；
(4)通過數(shù)字PCR儀采集熒光信號，分析得到血漿游離DNA中EGFR T790M位點的突變情況，計算突變比例信息。
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