[發明專利]一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系及其應用

在審

• 申請號: 202011285344.3
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112210606A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 王雨倩;徐梅波
• 申請（專利權）人: 遠辰生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州吳韻知識產權代理事務所(普通合伙) 32364
• 代理人: 王銘陸

1.一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，包含引物探針混合物，其特征在于，所述引物探針混合物由一對檢測EGFR T790M位點的特異性引物和一對檢測EGFR T790M位點的特異性探針組成：

(1)所述特異性引物包括：

EGFR T790M正向引物：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’，

EGFR T790M反向引物：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3’；

(2)所述特異性探針包括：

EGFR T790M野生型探針：5’-TGAGCTGCGTGATGAG-3’，

EGFR T790M突變型探針：5’-TGAGCTGCATGATGAG-3’。

2.根據權利要求1所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針5’端具有VIC熒光基團修飾，突變型探針5’端具有FAM熒光基團修飾。

3.根據權利要求1所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針和突變型探針的3’末端經過雙脫氧修飾、氨基修飾或磷酸化修飾以阻斷探針在擴增過程中延伸；優選地，所述探針的3’末端位修飾MGB非熒光淬滅基團。

4.根據權利要求1所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述野生型探針和突變型探針的核苷酸序列中下劃線標注的核苷酸為經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸。

5.根據權利要求4所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸為鎖核酸修飾的核苷酸或者肽核酸修飾的核苷酸。

6.根據權利要求5所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述經過修飾以增強所述探針與互補鏈的熱穩定性的核苷酸為鎖核酸修飾的核苷酸：

EGFR T790M野生型探針：5’-TGAGCTGC/iXNA_G/TGATGAG-3’，

EGFR T790M突變型探針：5’-TGAGCTGC/iXNA_A/TGATGAG-3’。

7.根據權利要求1所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述檢測體系由10*引物探針混合物、ddPCR-酶反應液、模板DNA和去離子水組成。

8.根據權利要求7所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，其特征在于，所述引物探針混合物的濃度分別為：

EGFR T790M正向引物濃度為4.5-10.0μmol/L；

EGFR T790M反向引物濃度為4.5-10.0μmol/L；

EGFR T790M野生型探針濃度為3.5-6.0μmol/L；

EGFR T790M突變型探針濃度為3.5-6.0μmol/L。

9.根據權利要求7或8所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系的應用，其特征在于，所述檢測體系用于檢測血漿游離DNA EGFR T790M位點突變。

10.根據權利要求9所述的EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系的應用，其特征在于，檢測血漿游離DNA EGFR T790M位點突變方法包括如下步驟：

(1)提取血漿樣本的游離DNA；

(2)采用由10*引物探針混合物、ddPCR-酶反應液、模板DNA和去離子水組成的檢測體系配制擴增反應；

(3)按照如下擴增條件進行反應：95℃熱啟動，10分鐘；94℃變性，30秒；60-62℃退火，60秒；擴增40個循環；98℃酶失活，10分鐘；4℃保溫，反應結束；

(4)通過數字PCR儀采集熒光信號，分析得到血漿游離DNA中EGFR T790M位點的突變情況，計算突變比例信息。