[發明專利]一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系及其應用

在審

• 申請號: 202011285344.3
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112210606A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 王雨倩;徐梅波
• 申請（專利權）人: 遠辰生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州吳韻知識產權代理事務所(普通合伙) 32364
• 代理人: 王銘陸

本發明提供了一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系及其應用。所述檢測體系包含EGFR T790M位點的特異性擴增引物和野生型、突變型探針，通過優化PCR擴增體系中引物探針的濃度比例，使得整個檢測體系的靈敏度和穩定性大幅度提高。同時通過引入特異性的探針修飾技術增強EGFR T790M位點的檢測效率，尤其是使用鎖核酸技術增強野生型和突變型探針與對應位點核苷酸的結合，顯著的提高了低濃度血漿游離核酸(cfDNA)樣本的檢測效率。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系及其應用。

背景技術

研究表明，癌癥是環境因素與細胞遺傳物質相互作用的結果，是多因素、多階段與多基因作用的結果，是基因突變累積的結果。在人類眾多的基因中，原癌基因和抑癌基因與癌癥的發生發展密切相關。原癌基因和或抑癌基因的突變可引起細胞癌變。癌癥在形成實性腫塊以前，已有微量腫瘤DNA釋放到循環血液中。通過測序、PCR等基因檢測技術檢測循環血液中這些基因的突變，可以篩查早期或超早期癌癥，評估放化療的療效，預測靶向藥物的療效，監測術后早期復發等；對腫瘤組織進行基因突變檢測，有助于了解腫瘤的產生、發展過程，判斷腫瘤的類型和預后；有助于預測原癌基因相關抗腫瘤藥物的療效。

目前臨床上使用的針對EGFR(表皮生長因子受體)的靶向藥物是EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)。EGFR-TKI通過抑制EGFR自身磷酸化而阻斷EGFR信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞增殖分化，實現靶向治療。EGFR-TKI的療效與EGFR基因突變狀況密切相關。EGFR基因位于人類的7號染色體短臂，由28個外顯子組成，成熟的EGFR含1186個氨基酸，相對分子質量為170KD，屬于受體絡氨酸激酶(TKI)家族。EGFR與配體結合后能導致其二聚體化和胞內區磷酸化，進而激活其下游的一系列信號通路，主要包括Src/STAT通路、PI3K/Akt通路和Ras-Raf-MEK-Erk/MAPK通路等，從而調控細胞的生長、分化、侵襲和抗凋亡等多個生理過程。EGFR基因T790M位點突變被一致認為是導致EGFR-TKI繼發性耐藥的主要原因，也是第一個被發現的與耐藥相關的基因。由于EGFR基因突變的患者采用EGFR-TKI治療能獲益，因此EGFR野生型患者不推薦使用EGFR-TKI治療。

血漿游離DNA(cfDNA,，又稱血液循環DNA)是指血液中游離于細胞外的DNA，其來源主要有三：白細胞崩解釋放的DNA、壞死組織特別是腫瘤組織釋放入血液的DNA和感染病毒、細菌的DNA。近幾年來，隨著基因診斷技術的發展，游離核酸的應用價值越來越大，如優生篩查、腫瘤早期診斷、遺傳病檢測和病原體感染基因檢測等。但血液中游離DNA含量一般較低，片段較小，不易提取，這大大影響了游離核酸的基因檢測和各種研究的開展。

因此，提供一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，以提高檢測結果的靈敏度和特異性，尤其是在血漿游離DNA(cfDNA)的檢測中具有廣闊的應用前景和巨大的市場價值。

發明內容

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供一種利用數字PCR技術檢測血漿游離DNA基因突變的方法，所述體系通過引入特異性的探針修飾技術增強EGFR T790M位點的檢測效率，優化檢測條件及引物濃度，最終實現了對血漿游離DNA樣品的高效、準確和靈敏的檢測，具有廣闊的應用前景和巨大的市場價值。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種EGFR T790M位點的數字PCR檢測體系，包含引物探針混合物，所述引物探針混合物由一對檢測EGFR T790M位點的特異性引物和一對檢測EGFRT790M位點的特異性探針組成：

(1)所述特異性引物包括：

EGFR T790M正向引物：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’，