[發明專利]一種通過組織離體培養獲得落葉松再生植株的方法

在審

• 申請號: 202011283503.6
• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112335549A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 李慧;王春國;陳成彬
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明涉及一種通過組織離體培養獲得落葉松再生植株的方法。包括以下步驟：落葉松材料的培養；落葉松離體組織的獲取、消毒；落葉松離體組織脫分化及增殖培養；不定芽誘導及生長；不定根誘導及增殖；落葉松再生植株煉苗及移栽等步驟。本發明充分利用植物細胞的全能性結合組織培養技術，可以快速、高效且不受季節限制，規?；@得落葉松再生植株，實現落葉松優良品系的快速、規模化繁育，避免通過種子繁育周期長、性狀不穩定的造林難題，為落葉松更好的服務于經濟建設和環境保護提供重要保障繁育策略。

技術領域

本發明涉及落葉松組織離體培養獲得再生植株的方法。通過本發明可以實現落葉松優良品系的快速、規模化繁育，克服落葉松種子繁育時間長的造林難題。同時本發明也為通過遺傳工程手段獲得轉基因或基因編輯落葉松提供了遺傳轉化體系。本發明屬于農林科技及生物技術領域。

背景技術

落葉松是重要的用材和綠化樹種，其適應性強，耐腐性強，并具有生態保護功能。因此，落葉松具有經濟和環境雙重價值，在我國及世界各地廣泛種植。雜交育種是獲得落葉松優良品系的主要方法，但落葉松生長周期長、遺傳背景復雜，其很難像農作物雜交育種一樣，可以在較短的時間內獲得純合親本，并通過雜交獲得具有明顯雜種優勢且性狀一致的雜合后代。因此，在短時間內獲得速生、優質落葉松植株一直是落葉松繁育及造林中需要攻克的難題?，F代生物技術的迅速發展，特別是基于植物外植體的離體培養技術的發展，為在短時間內獲得大量再生植株奠定了堅實基礎。在植物中利用該方法獲得再生植株具有如下優點：（1）遺傳穩定性好。由于再生植株是通過克隆化培養獲得，因此優良性狀可以被再生植株完全保留；（2）周期短。無需通過有性繁殖，而是直接利用植物細胞的全能性獲得再生植株，不受植株生長周期及季節的限制，可以在室內實現再生植株的規模化產出?；诖耍媒M織離體培養獲得落葉松再生植株具有重要的經濟價值。同時，落葉松離體組織培養體系的建立也為通過基因工程手段獲得轉基因落葉松奠定了堅實基礎，在落葉松轉基因育種中具有重要應用潛力。

發明內容

本發明的目的是提供一種通過組織離體培養獲得落葉松再生植株的方法，通過該方法可以實現落葉松優良品系的快速、規?；庇?，克服落葉松種子繁育時間長的造林難題，在落葉松優良品系種苗繁育中具有重要價值。同時本發明也為通過遺傳工程手段獲得轉基因落葉松提供了遺傳轉化體系，在落葉松轉基因育種中具有重要應用潛力。

為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：

一種通過組織離體培養獲得落葉松再生植株的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）落葉松材料的培養：購買當年采收的落葉松成熟種子，將其置于4℃冰箱低溫處理14天挑選成熟飽滿種子在室溫下震蕩浸泡48h，浸泡液中含有400 mg/L赤霉素及2%的纖維素酶，后用自來水沖洗3次；將處理并洗凈的落葉松種子撒播于滅菌河沙土中，再在落葉松種子上覆蓋一層0.5 cm厚的沙土，保持沙土濕潤，在溫度為22-23℃的培養室內培養30天收獲落葉松幼苗材料；

（2）落葉松離體組織的獲取、消毒：收獲生長20-30天的落葉松幼苗地上部分，采用5%的次氯酸鈉溶液清洗6 min，每次2 min，共3次；無菌水清洗3次，每次2 min；75%的乙醇消毒1min，迅速用無菌蒸餾水清洗3次，接著用0.1%的氯化汞溶液震蕩浸泡并消毒2min，最后用無菌水清洗6次，每次2min；清洗結束后將落葉松幼苗地上部分放在滅菌的濾紙上晾干，剪去傷口壞死的部分，從而獲得落葉松離體組織無菌材料；

（3）落葉松離體組織脫分化及增殖培養：選取上述無菌落葉松幼苗地上部分的下胚軸，采用無菌手術刀將其切成0.5 cm長的莖段，置于含有4.0 mg/L 6-BA（6-芐基腺嘌呤） +0.2 mg/L NAA（萘乙酸）+0.5 mg/L ZT（玉米素）的1/2MS培養基中，在黑暗條件下誘導落葉松離體組織下胚軸脫分化并進行愈傷組織誘導；