[發(fā)明專利]一種通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株的方法

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• 申請日: 2020-11-17
• 公開（公告）號: CN112335549A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設計）人: 李慧;王春國;陳成彬
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）落葉松材料的培養(yǎng)：購買當年采收的落葉松成熟種子，將其置于4℃冰箱低溫處理14天挑選成熟飽滿種子在室溫下震蕩浸泡48h，浸泡液中含有400 mg/L赤霉素及2%的纖維素酶，后用自來水沖洗3次；將處理并洗凈的落葉松種子撒播于滅菌河沙土中，再在落葉松種子上覆蓋一層0.5 cm厚的沙土，保持沙土濕潤，在溫度為22-23℃的培養(yǎng)室內培養(yǎng)30天收獲落葉松幼苗材料；

（2）落葉松離體組織的獲取、消毒：收獲生長20-30天的落葉松幼苗地上部分，采用5%的次氯酸鈉溶液清洗6 min，每次2 min，共3次；無菌水清洗3次，每次2 min；75%的乙醇消毒1min，迅速用無菌蒸餾水清洗3次，接著用0.1%的氯化汞溶液震蕩浸泡并消毒2min，最后用無菌水清洗6次，每次2min；清洗結束后將落葉松幼苗地上部分放在滅菌的濾紙上晾干，剪去傷口壞死的部分，從而獲得落葉松離體組織無菌材料；

（3）落葉松離體組織脫分化及增殖培養(yǎng)：選取上述無菌落葉松幼苗地上部分的下胚軸，采用無菌手術刀將其切成0.5 cm長的莖段，置于含有4.0 mg/L 6-BA的1/2MS培養(yǎng)基中，在黑暗條件下誘導落葉松離體組織下胚軸脫分化并進行愈傷組織誘導；

誘導出愈傷組織后，將愈傷組織轉接到含有2.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L KT（激動素）+ 0.1 mg/L ZT的1/2MS培養(yǎng)基中誘導愈傷組織進行增殖生長；

（4）不定芽誘導及生長：將增殖培養(yǎng)5周左右的落葉松愈傷組織轉接到含有0.5 mg/L6-BA + 0.05 mg/L NAA+2%殼聚糖的1/2MS培養(yǎng)基中進行不定芽的誘導，21-28天，愈傷組織的綠色區(qū)域誘導出不定芽；

將產生的不定芽轉到含有1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L KT + 0.1 mg/L IBA+ 2%殼聚糖的1/2MS培養(yǎng)基中進行不定芽伸長培養(yǎng)，兩周后觀察芽的生長情況：芽葉片顏色正常，葉片密集，生長狀態(tài)良好；

（5）不定根誘導及增殖：取2-3 cm長的不定芽的末端平切少許莖段，轉接到含有1.0mg/L IBA+2%殼聚糖+0.05 mg/L ZT的1/2MS培養(yǎng)基中進行不定根的誘導及增殖，42天，不定根形成，并在主根上延伸出側根；

（6）落葉松再生植株煉苗及移栽：落葉松再生幼苗生長出發(fā)達的根系后，打開培養(yǎng)瓶，將其放置在組織培養(yǎng)室中2-3天，溫度為22-23℃，同時向培養(yǎng)瓶中直接添加少量蒸餾水，以保持水分；用小刀切斷生根苗與底部培養(yǎng)基的聯(lián)系，防止根部受損，再用鑷子取出試管幼苗，用水仔細洗掉根部培養(yǎng)基；將洗過的幼苗移入裝有無菌混合土壤的花盆中，輕輕壓實土壤，將其置于栽培室，溫度為22-23℃，光照周期16h/d，定期澆水，保持土壤濕潤；經過4-8周，若移栽的落葉松頂芽繼續(xù)生長，則表明再生幼苗移栽成活。

2.權利要求1所述的一種通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株的方法，其特征在于：所述步驟（3）中落葉松離體組織脫分化及增殖培養(yǎng)的愈傷誘導培養(yǎng)基為1/2MS+4.0 mg/L6-BA + 0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT；愈傷組織增殖培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA + 0.1mg/L KT + 0.1 mg/L ZT。

3.權利要求1所述的一種通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株的方法，其特征在于：所述步驟（4）不定芽誘導培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA+2%殼聚糖；不定芽伸長增殖培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L KT + 0.1 mg/L IBA+ 2%殼聚糖。

4.權利要求1所述的一種通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株的方法，其特征在于：所述步驟（5）不定根誘導及增殖培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+2%殼聚糖+0.05 mg/L ZT。

5.權利要求1所述通過組織離體培養(yǎng)獲得落葉松再生植株方法在提高落葉松優(yōu)良品系的快速、規(guī)模化繁育方面的應用。