[發明專利]一種消化染色液及結晶紫染色細胞核計數方法

在審

• 申請號: 202011280605.2
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112393961A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 梁智杰;黃林;崔利凱;李高軍
• 申請（專利權）人: 成都柏奧特克生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N15/10
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;鄭勇力

本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種消化染色液及結晶紫染色細胞核計數方法。針對現有技術在片狀載體貼壁培養模式中胰酶消化液消化時間不易控制，且即使消化后的細胞也不能完全脫離網狀空間的問題，本發明的技術方案是：提供一種消化染色液，其是包括結晶紫、檸檬酸與曲拉通X?100的混合溶液。結晶紫染色細胞核計數方法包括如下步驟：(1)將載有細胞的載體與所述的消化染色液混合，進行染色和消化，得到染色液；(2)對染色液進行細胞核計數。本發明還提供曲拉通X?100在細胞核計數過程中用于消化貼壁細胞的用途。本發明方法能夠減少消化過程中時間過長導致的細胞受損甚至死亡的現象，從而提高細胞計數的準確性。

技術領域

本發明生物化學技術領域，具體涉及一種消化染色液及結晶紫染色細胞核計數方法。

背景技術

目前，市場上主流疫苗廠家的細胞、病毒大規模培養，普遍采用微載體生物反應器、片狀載體生物反應器、轉瓶或者細胞工廠等培養方式。在固定床生物反應器中，片狀載體被固定在一個籃子形狀的區域，攪拌槳置于中間空腔，不與細胞直接接觸，槳葉的轉動使培養液通過載體裝載區向上流動，并從中間空腔回流到底部，形成回路，通氧、pH調節均在中間空腔進行。固定床(片狀載體)生物反應器培養的結構如圖1所示。此類固定床生物反應器，攪拌系統不與細胞直接接觸，對細胞的剪切力小；細胞完全處于液面以下，減少液面產生的泡沫對細胞的損傷；通氣、pH調節在中間空腔進行，因為通氣產生的氣泡也在空腔，不會進入細胞載體區域，避免了氣泡對細胞的損傷。因此固定床生物反應器在貼壁細胞大規模培養中的運用越來越廣泛。

在應用固定床生物反應器培養細胞的過程中，為了了解細胞生長的階段和生長的狀態，需要通過細胞計數的方式實時對固定床生物反應器中的細胞密度進行檢測。

現有技術中，對細胞懸液的計數方法非常地成熟和簡便，因而在對貼壁的細胞進行計數時，需要先把貼壁生長的細胞制備成細胞懸液，然后進行細胞計數，可使用血小板或全自動細胞計數多種計數方式。該方法的關鍵就是確保生長的細胞都能被消化制備成細胞懸液。現有技術通常使用胰酶消化液或類似重組消化液進行細胞消化后計數，采用胰酶消化或重組消化液消化的缺點在于消化時間長短難以控制，時間過短不能完全消化，而如果消化時間過長又會導致細胞受損甚至死亡，對于常規的細胞懸液計數方法(例如電容法)，細胞死亡會影響計數的結果。此外，對于貼壁在網狀空間中(如片狀載體)細胞，由于空間結構導致即使消化后的細胞也不能完全脫離網狀空間。這進一步導致了采用胰酶消化液或重組消化液的細胞計數方法準確性欠佳。

可見，目前對于固定床生物反應器中貼壁細胞的計數，由于消化液的缺陷影響了技術結果的準確性。

發明內容

針對現有技術中由于消化液的缺陷影響了技術結果的準確性的問題，本發明提供一種消化染色液及結晶紫染色細胞核計數方法，其目的在于：通過選用傳統的細胞核計數方法中采用的傳統消化染色試劑，并創新性地加入檸檬酸，有效提高了對固定床生物反應器中貼壁細胞的細胞計數的準確性。

一種消化染色液，其是包括結晶紫、檸檬酸與曲拉通X-100的混合溶液。

優選的，其是溶解有如下組分的水溶液：

結晶紫1.00～1.5g/L；

檸檬酸20～21.00g/L；

曲拉通X-100 0.5～1.00ml/L。

本發明還提供一種結晶紫染色細胞核計數方法，包括如下步驟：

(1)將載有細胞的載體與上述消化染色液混合，進行染色和消化，得到染色液；

(2)對步驟(1)得到的染色液進行細胞核計數。

優選的，步驟(1)所述染色和消化的過程為在37±1℃下加熱30～35min。

優選的，加熱過程中每10～15min對體系進行搖晃。