[發(fā)明專利]Hsp16-3過(guò)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011278428.4
• 申請(qǐng)日: 2020-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN112280729A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張萬(wàn)江;李垚;陳雪峰;王菊;張春軍;張杰;董江濤;吳芳;吳江東;柳小玲;梁粟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12R1/32
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)核桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16?3（以下簡(jiǎn)稱Hsp16?3）過(guò)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株H37Ra菌（以下簡(jiǎn)稱H37Ra菌）菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用。首次利用電穿孔技術(shù)，將構(gòu)建的大腸桿菌?結(jié)核桿菌重組穿梭質(zhì)粒載體pMV361?Hsp16?3，轉(zhuǎn)入H37Ra菌，篩選并鑒定，確定成功構(gòu)建的菌株，為Hsp16?3基因過(guò)表達(dá)的H37Ra菌株。本發(fā)明構(gòu)建的Hsp16?3過(guò)表達(dá)的H37Ra菌，增強(qiáng)了Hsp16?3基因的表達(dá)，將提升H37Ra菌對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)，為探索研究Hsp16?3對(duì)H37Ra菌的致病性、免疫保護(hù)作用等方面的調(diào)控作用，以及新型結(jié)核病疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程研究領(lǐng)域，以及結(jié)核桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16-3（以下簡(jiǎn)稱Hsp16-3）過(guò)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株H37Ra菌株（以下簡(jiǎn)稱H37Ra菌）的構(gòu)建及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)核病是世界上嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。世界衛(wèi)生組織(WHO)所發(fā)布的2019年全球結(jié)核病報(bào)告中顯示，2018年，全球范圍內(nèi)據(jù)估約有1000萬(wàn)結(jié)核病新發(fā)病例，89%的患者為成年患者（≥15歲）。據(jù)估計(jì)，2018年HIV陰性患者因結(jié)核病死亡約120萬(wàn)例，HIV陽(yáng)性患者因結(jié)核病死亡約25.1萬(wàn)例。卡介苗（BCG）是目前世界范圍內(nèi)唯一廣泛使用的抗結(jié)核疫苗。雖然卡介苗控制兒童結(jié)核病十分有效，但對(duì)成人結(jié)核病的預(yù)防效果在不同地區(qū)表現(xiàn)出極大差異（0-80%）。隨著耐藥和耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)與流行，迫切需要研發(fā)安全高效的結(jié)核病疫苗。

全球約有1/3人口被結(jié)核桿菌潛伏感染，該人群在免疫力下降，尤其是免疫系統(tǒng)受到損害時(shí)，則會(huì)發(fā)展成為結(jié)核病，潛伏性感染者已成為結(jié)核病患者的一個(gè)重要來(lái)源。潛伏性結(jié)核感染以皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，及(或) γ干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性，而無(wú)活動(dòng)性結(jié)核的臨床表現(xiàn)為特點(diǎn)。結(jié)核桿菌Hsp16-3與結(jié)核桿菌潛伏感染之間密切相關(guān)。結(jié)核桿菌在低氧或缺氧狀態(tài)時(shí)會(huì)大量合成Hsp16-3，當(dāng)結(jié)核桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞后期，Hsp16-3的表達(dá)量明顯增多，T細(xì)胞可以特異性的識(shí)別Hsp16-3，并將其從被感染的巨噬細(xì)胞中分離出來(lái)，這種反應(yīng)在結(jié)核桿菌潛伏期則更為明顯，這說(shuō)明Hsp16-3在結(jié)核桿菌潛伏性感染階段扮演著重要的角色。

Hsp16-3對(duì)研發(fā)新型結(jié)核病疫苗有重要的科學(xué)價(jià)值。Hsp16-3能夠誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，具有鼠和人的T淋巴細(xì)胞表位，是有效的亞單位疫苗的靶抗原。宿主對(duì)結(jié)核桿菌等細(xì)胞內(nèi)寄生菌的防御主要依賴于有效的細(xì)胞免疫，其機(jī)制為被感染的巨噬細(xì)胞被細(xì)胞免疫因子所激活，尤其是由自然殺傷細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素。Hsp16-3抗原能夠部分活化結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)試驗(yàn)陽(yáng)性機(jī)體的外周血單核細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)，并分泌干擾素，有效清除結(jié)核桿菌；同時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞可以識(shí)別Hsp16-3的多肽表位，活化的CD8+T淋巴細(xì)胞可以誘導(dǎo)產(chǎn)生γ干擾素和α干擾素，從而通過(guò)粒細(xì)胞溶解素和表位穿孔素溶解被結(jié)核桿菌感染的巨噬細(xì)胞，因此，對(duì)Hsp16-3的研究可以為安全高效的新型結(jié)核病疫苗研究提供理論依據(jù)，尤其是對(duì)潛伏感染者可能起到有效預(yù)防作用。

基于此，我們提出構(gòu)建Hsp16-3過(guò)表達(dá)的H37Ra菌株，具有以下的優(yōu)勢(shì)：

第一，Hsp16-3過(guò)表達(dá)的H37Ra菌株，可增強(qiáng)其免疫原性，可產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答，提高對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)作用，有可能單獨(dú)作為結(jié)核病疫苗使用；

第二，為探索結(jié)核桿菌的致病機(jī)制及控制結(jié)核病的傳播提供依據(jù)，同時(shí)為尋找抗結(jié)核藥物靶標(biāo)提供新的方向。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明的目的在于提供Hsp16-3過(guò)表達(dá)的H37Ra菌株的構(gòu)建方法，并在Hsp16-3基因功能研究的基礎(chǔ)上，探討對(duì)結(jié)核病的有效防治。

本發(fā)明目的，一是構(gòu)建Hsp16-3過(guò)表達(dá)的H37Ra菌株，用于結(jié)核病預(yù)防和新型結(jié)核病疫苗研發(fā)。