[發(fā)明專利]一種小鼠截短IL-36γ蛋白及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011278371.8
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112358539A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱俊豐;徐瑩;任蕾;劉姍姍
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/54
• 分類號: C07K14/54;C12N15/24;C12N15/70;C07K1/22;A61P37/02;A61P1/00;A61P29/00;C12R1/19
• 代理公司: 西安匯恩知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61244
• 代理人: 張延長

1.一種小鼠截短IL-36γ蛋白，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

2.一種制備如權(quán)利要求1所述的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，其特征在于，該方法為：

S1、構(gòu)建pUC57-mIL-36γ質(zhì)粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57載體質(zhì)粒，構(gòu)建pUC57-mIL-36γ質(zhì)粒；

S2、PCR擴(kuò)增：以P1和P2為特異性引物，在引物的兩側(cè)導(dǎo)入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述P1特異性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特異性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；

S3、重組表達(dá)載體pET28a-mIL-36γ的構(gòu)建：將pET28a載體質(zhì)粒和S2中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別均用NcoⅠ內(nèi)切酶和XhoⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，雙酶切后凝膠回收pET28a載體和IL-36γ，將回收后的pET28a載體與IL-36γ經(jīng)T4連接酶定向連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-mIL-36γ；

S4、轉(zhuǎn)化：將S3中得到的重組表達(dá)載體pET28a-mIL-36γ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，得到IL-36γ重組工程菌；

S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將S4中得到的IL-36γ重組工程菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、搖速為200r/min的條件下震蕩培養(yǎng)12h～14h后，以1:100的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在溫度為37℃、搖速為210r/min的條件下震蕩培養(yǎng)3h，至OD600達(dá)到0.6時止，加入濃度為0.7mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心后，得到菌體；

S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的純化：采用超聲破碎法將S5中得到的菌體進(jìn)行超聲裂解后離心，取上清液；

S7、用Ni-NAT柱對S6中得到的上清液進(jìn)行純化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S2中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×PfuMaster Mix 25μL，P1特異性引物2μL、P2特異性引物2μL、pUC57-mIL-36γ質(zhì)粒0.2μL，雙蒸水補(bǔ)足至50μL；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，擴(kuò)增30個循環(huán)；72℃延伸10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S5中所述LB培養(yǎng)基中的卡那霉素的濃度為50mg/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S5中所述誘導(dǎo)表達(dá)的條件為溫度為20℃，搖速為120r/min的條件下誘導(dǎo)20h。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S5中離心的轉(zhuǎn)速為4000rpm～5000rpm，離心的時間為5min～10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S6中離心的轉(zhuǎn)速為8000rpm～10000rpm，離心的時間為10min～20min。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S6中超聲裂解的反應(yīng)條件為：在功率為150W～200W的條件下，超聲3s～5s，然后停止3s～5s，循環(huán)進(jìn)行，共計(jì)進(jìn)行45min～50min。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，S7中純化的方法為：用濃度為50mmol/L的咪唑溶液洗脫雜蛋白，用濃度為200mmol/L的咪唑溶液洗脫截短IL-36γ蛋白。