[發明專利]一種生產L-瓜氨酸的基因工程菌株及其應用

有效

• 申請號: 202011277574.5
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112280728B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 謝希賢;文晨輝;蔣帥;吳鶴云;秦臻;朱彥凱;王加初;朱永鐸;李镠
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/71;C12P13/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明提供一株高效穩定生產L?瓜氨酸的基因工程菌株CIT 4，該菌株是以大腸桿菌為宿主，首先使宿主缺失精氨基琥珀酸合酶活性，以阻斷L?瓜氨酸降解為精氨酸琥珀酸；還在宿主基因組上整合了編碼大腸桿菌精氨基琥珀酸合酶的基因argG，并由色氨酸啟動子P_trp進行表達調控；還使宿主缺失乙酰鳥氨酸脫乙酰基酶活性；還在宿主基因組上整合了谷氨酸棒桿菌編碼谷氨酸乙酰基轉移酶的基因argJ，以此加強由谷氨酸合成乙酰谷氨酸過程中的代謝流量；還在宿主基因組上整合了枯草芽孢桿菌突變株A260編碼氨甲酰磷酸合成酶兩個亞基的基因pyrAA、pyrAB，以解除精氨酸對氨甲酰磷酸合成酶的反饋抑制，提高前體物質氨甲酰磷酸的供應。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種生產L-瓜氨酸的基因工程菌株及其構建方法與應用。

背景技術

L-瓜氨作為一種非蛋白質α-氨基酸，具有重要的生化和生理學功能。目前，L-瓜氨酸已在醫藥、工業、食品、化妝品、畜牧業等領域有廣泛的應用，具有重要的經濟和社會價值。L-瓜氨酸的生產方法主要包括化學合成法、酶催化法、微生物發酵法。化學合成法主要是將L-精氨酸在堿性條件下水解直接得到L-瓜氨酸。此法產率較低，環境污染大，而且生產過程中容易產生D型旋光對映體，造成后期產品分離純化成本很高，因此化學合成法很難投入到實際應用中；酶催化法主要是以L-精氨酸為底物，利用精氨酸脫亞胺酶一步酶促反應直接將底物轉變為L-瓜氨酸。但是精氨酸脫亞胺酶普遍具有穩定性不高的特點，難以實現酶的重復利用，而且在生產過程中需要耗費大量的發酵原料，工業成本較大，限制了酶催化法生產L-瓜氨酸的工業化應用；微生物發酵法是通過誘變篩選出高產型突變株或者通過代謝改造模式菌株實現以廉價碳源直接發酵生產L-瓜氨酸的目的，采用發酵法生產L-瓜氨酸生產工藝相對簡單、對環境影響相對較小、產品純度高，適合大規模工業生產。

由于L-瓜氨酸合成代謝途徑中存在諸多反饋調控，整個合成途徑很長，并且合成L-瓜氨酸所需前體物涉及到的代謝網絡復雜，因此最初利用微生物發酵法生產L-瓜氨酸的工業生產菌株主要采用傳統誘變結合結構類似物抗性篩選的方法獲取。研究策略集中在篩選結構類似物突變體，以解除L-瓜氨酸合成過程中的反饋調控，提高胞內L-瓜氨酸的積累量。其中，Okumura Shinji等經過X射線逐級誘變篩選到一株精氨酸需求型突變菌株(US3282794)，經過96h發酵培養，L-瓜氨酸氨酸的積累量為19g/L。但是經過誘變篩選得到的生產菌株，存在遺傳穩定性差，容易產生回復突變等缺點很難投入到大批量工業生產中。

隨著基因工程技術的飛速發展，運用代謝工程技術構建L-瓜氨酸生產菌株的方法逐漸替代了傳統誘變育種方法。谷氨酸棒狀桿菌作為傳統的氨基酸發酵生產菌株，其胞內攝取的葡萄糖經過糖酵解途徑生成谷氨酸的代謝流量較強，而谷氨酸作為L-瓜氨酸合成的主要的前體物之一，因此谷氨酸棒狀桿菌作為構建L-瓜氨酸生產菌株的主要選擇。謝紅翠等以谷氨酸棒狀桿菌為出發菌株，敲除L-瓜氨酸降解相關基因argG，然后將合成L-瓜氨酸的基因簇argCJBDF連接到組成型載體pXMJ19-lacI上，并將其導入谷氨酸棒狀桿菌中(DOI:10.3969/j.issn.1671-7627)。該菌株經過72h搖瓶發酵后，L-瓜氨酸產量為4.33g/L。Hao等以谷氨酸棒狀桿菌為出發菌株，通過敲除L-瓜氨酸降解的基因argG及編碼阻遏蛋白的argR基因，并在此基礎上導入重組質粒pXMJ19-argJ，以增強鳥氨酸乙酰基轉移酶的表達(DOI:10.1007/s10295-014-1561-x)。最終經過72h搖瓶發酵后，L-瓜氨酸的積累量為8.51g/L，對該菌株進行搖瓶發酵培養條件優化(DOI:10.3969/j.issn.1672-3678)，經搖瓶培養72h后該菌株L-瓜氨酸的積累量為14.96g/L。上述生產菌株普遍存在生產周期長，生產強度低，生產易波動，菌體生長受限等問題，而且發酵過程中需要額外添加精氨酸，造成生產成本過大，同時在菌株構建過程中采用將L-瓜氨酸合成關鍵基因連接到表達載體上以提高關鍵酶的轉錄量，在生產過程中表達載體容易丟失或者需要加入一定的選擇性壓力，限制了菌株的工業化應用。