[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)L-瓜氨酸的基因工程菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011277574.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN112280728B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝希賢;文晨輝;蔣帥;吳鶴云;秦臻;朱彥凱;王加初;朱永鐸;李镠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/71;C12P13/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

1.一株產(chǎn)L-瓜氨酸的基因工程菌株，其特征在于，該菌株是以大腸桿菌為宿主，敲除編碼精氨基琥珀酸合酶基因argG；進(jìn)一步地，構(gòu)建啟動(dòng)子P_trp與大腸桿菌編碼精氨基琥珀酸合酶的基因argG的連接片段，并將其整合至宿主的yeeP基因位點(diǎn)；進(jìn)一步地，敲除宿主中編碼乙酰鳥氨酸脫乙?；傅幕?Italic>argE，并構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc與谷氨酸棒桿菌編碼谷氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因argJ的連接片段整合至該位點(diǎn)；進(jìn)一步地，構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc與枯草芽孢桿菌A260的pyrAA-pyrAB基因的連接片段，并將其整合至宿主的yjiT基因位點(diǎn)，獲得所述基因工程菌株。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主為E. coli MG1655。

3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述色氨酸啟動(dòng)子P_trp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一種制備L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述方法是在適宜條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-3任一所述基因工程菌，并從其培養(yǎng)物中收集L-瓜氨酸。

5.如權(quán)利要求4所述的制備L-瓜氨酸的方法，其特征在于，所述適宜條件是指在37℃，200 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)一步地，發(fā)酵過程中通過補(bǔ)加氨水維持pH在7.0-7.2，補(bǔ)加60% (m/v)葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵周期28 h；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物1-5 g/L，蛋白胨1-5 g/L，K₂HPO₄ 1-3 g/L，檸檬酸鈉1-3g/L，MgSO₄·7H₂O1-3 g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 10-20 mg/L，MnSO₄·7H₂O 10-20 mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1-3 mg/L，色氨酸0.1-0.5 g/L，其余為水，pH 7.0-7.2。

6.一種產(chǎn)L-瓜氨酸的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因工程菌是采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對(duì)宿主E. coli MG1655進(jìn)行定向改造所得，包括如下步驟：

（1）敲除宿主中編碼精氨基琥珀酸合酶的基因argG；

（2）構(gòu)建啟動(dòng)子P_trp與大腸桿菌編碼精氨基琥珀酸合酶的基因argG的連接片段，并將其整合至宿主的yeeP基因位點(diǎn)；

（3）敲除宿主中編碼乙酰鳥氨酸脫乙?；傅幕?Italic>argE，并構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc與谷氨酸棒桿菌編碼谷氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因argJ的連接片段整合至該位點(diǎn)；

（4）構(gòu)建啟動(dòng)子P_trc與枯草芽孢桿菌A260的pyrAA-pyrAB基因的連接片段，并將其整合至宿主的yjiT基因位點(diǎn)。